Estudios de Histamina en Sistemas Biológicos por Electroforesis Capilar. Desarrollo y optimización de la Metodología

GIORGIERI S.A; MARIÁNGELO J.I; DOCENA G; DIAZ L.E

Mendoza

Congreso; VII Congreso Argentino de Química Analítica; 2013

Asociación Argentina de Químicos Analíticos (AAQA) y la Universidad Nacional de Cuyo

La histamina o 2-(4-imidazolil)etilamina es una amina orgánica con actividad farmacológica que se origina por metabolización enzimática, catalizado por la L-histidin descarboxilasa, de la histidina a partir de las que la sintetizan (mastocitos, basófilos o neuronas) o por degradación bacteriana a partir de determinados alimentos (pescados, carne, queso, alimentados fermentados, etc). En las células se almacena en los gránulos citoplasmáticos y frente a distintos estímulos (calcio, alergenos, cambios de presión, de temperatura, soluciones hiperosmolares, etc) se induce su liberación al medio extracelular. Su potente acción pro-inflamatoria la ejerce a través de su unión a distintos tipos de receptores localizados en la membrana de distintas células. De esta manera es capaz de atraer (eosinófilos) o activar células (células endoteliales, células musculares lisas, células dendríticas, etc) e inducir un foco inflamatorio. Es una sustancia hidrofilica que se secreta en muy pequeñas cantidades (g/ml o g/g) y en circulación se degrada rápidamente por acción de diferentes enzimas (histamina-N-metiltransferasa y la diamina-oxidasa). Ejerce su acción biológica a través de su unión a 4 tipos de receptores (H1 a H4) que están acoplados a la proteína G, principalmente en células del sistema cardiovascular, sistema nervioso central y en células endoteliales de vasos periféricos. Para el caso en particular de las enfermedades alérgicas, tema de especial interés para nuestro grupo, la histamina es el principal mediador vasoactivo que se libera cuando mastocitos o basófilos son activados por la acción de un alergeno, que es reconocido por los anticuerpos IgE anclados a membrana plasmática. Esta sustancia se encuentra preformada y almacenada en los gránulos y frente a la activación celular se libera inmediatamente por movilización del citoesqueleto de la célula.  Es importante contar con métodos analíticos específicos, sensibles y de elevada eficiencia para dosar histamina en alimentos en descomposición (producto de su degradación) o en líquidos biológicos (producto de su liberación en pequeñas cantidades durante los procesos alérgicos). De esta manera una metodología adecuada permitiría monitorear los niveles de histamina en alimentos o en muestras biológicas para determinar el grado de descomposición de un alimento, o caracterizar el proceso inflamatorio respectivamente. Se han descripto y desarrollado distintos métodos analíticos desde ensayos in vivo o biológicos hasta métodos químicos. Actualmente existen en el mercado un reducido número de kits que dosan este metabolito por ELISA (Veratox, Immunotech) y la bibliografía describe numerosos métodos analíticos tales como HPLC, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía gaseosa, cromatografía en capa fina, espectrometría de masas que no son habitualmente empleados ya que requieren derivatizar la muestra, proceso durante el cual suele degradarse la histamina. Por lo tanto es importante implementar una metodología sencilla y directa para determinar este analito en forma nativa. La Electroforesis Capilar (EC) aparece como una técnica accesible para resolver estos problemas con sensibilidad y eficiencia adecuadas. Esta técnica permite determinar histamina como tal, utilizando volúmenes de muestra muy discretos (microlitros), con gran poder de resolución para analizar muestras muy complejas (muestras biológicas), importante para diferenciar metabolitos o analitos similares (aminas biogénicas). Por otro lado es de destacar los menores tiempos de análisis (minutos), y por ende menores costos operacionales, en comparación con otras metodologías mencionadas. Un punto crítico del análisis es la preservación de la estructura nativa de la histamina, principalmente cuando se encuentra en su medio natural, una matriz biológica, evitando alteraciones (oxidación, clivaje, etc).