Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens de gránulos de kéfir Argentinos. Aislamiento, identificación y caracterización reológica

HAMET F.; LONDERO A; PIERMARÍA J.; GARROTE G L; ABRAHAM A

Buenos aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología; 2010

Asociación Argentina de Microbiología

El gránulo de kefir está constituido en un 8 % por kefiran, un exopolisacárido (EPS) producido por  Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens. Este EPS posee propiedades funcionales comprobadas, actúa como gelificante, espesante y forma películas comestibles. Además posee capacidad de proteger el epitelio y actividad inmunomodulatoria. Su aislamiento es dificultoso ya que es anaerobio estricto y de crecimiento lento. El objetivo del trabajo es aislar L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens de gránulos de kefir argentino y analizar las propiedades reológicas de sus cultivos en leche. Debido a la falta de consenso acerca de la microflora existente en gránulos de kéfir, se analizo mediante una técnica molecular independiente del cultivo la presencia de  dicho microorganismos en 9 gránulos de la colección CIDCA. Para eso se les extrajo el DNA total y se amplifico con los oligunucleótidos sintéticos 518r y GC-338f. Estos productos y el obtenido de la cepa de referencia L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens JCM 6985 fueron analizados mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (urea/formamida 40-60%, 16 horas, 100 Voltios y a 60°C, SYBR gold). Las bandas coincidentes con la cepa de referencia fueron cortadas, amplificadas y secuenciadas. A partir de la confirmación de la existencia del microorganismo buscado se procedió al aislamiento. Se utilizaron tres técnicas de disgregación de gránulos de kefir: ruptura con ultraturrax, congelamiento y corte mecánico y disolución del gránulo en agua a 40°C. A partir de cada una de las suspensiones se realizaron aislamientos directos y con previo enriquecimiento en medio líquido (MRS pH 5, 7 días y anaerobiosis). Se obtuvieron 23 aislados que fueron caracterizados mediantes coloración de Gram, presencia de catalasa, crecimiento en leche, producción de gas a partir de glucosa y perfil de proteínas totales. La evaluación reológica se realizó en un reómetro Haake Rheostress 600 en modo rotacional. En base a los perfiles de proteínas se construyó un dendrograma donde se pudieron agrupar 8 aislados con el microorganismo buscado. A fin de confirmar su identidad se les extrajo DNA, amplificó y analizó por DGGE. Se utilizaron como referencias las cepas L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens JCM 6985, L. kefiranofaciens subsp. kefirgranum JCM 8572 . Las bandas fueron secuenciadas y contrastadas en una base de datos. Del total de 23 cepas aisladas solo ocho cepas provenientes de los gránulos AGK1, 2, 3, 5 y 6 coinciden con el perfil buscado. Como resultado de su secuenciación se obtuvo una homología de 98 a 100 % con L. kefiranofaciens subsp. kefirgranum/kefiranofaciens. Si bien el análisis de la secuencia no permitió diferenciar las dos subespecies la distancia relativa recorrida por ambas en los perfiles de DGGE marca una importante diferencia entre ambas. Del análisis de las cepas seleccionadas mediante viscosimetría rotacional se observó un comportamiento pseudoplástico con importantes áreas de histéresis. Los valores de viscosidad aparente a 300s-1 variaron entre 17,82 ± 1,05 y 35,96 ± 10,15 mPa.s y las áreas de histéresis entre 745,2 ± 35,64 y 1861 ± 613,77 Pa/s. Sólo dos de las cepas presentaron viscosidad equivalente a la cepa de referencia mostrando variabilidad en sus propiedades funcionales. Es importante destacar que es la primera vez que se aisla L. kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens de gránulos de kefir argentinos con potencialidad para su aplicación en nuevos desarrollos tecnológicos como lo son los alimentos funcionales.