Caracterización genética de la enzima alfa-galactosidasa de Lactobacillus fermentum CRL722

DIEZ REPETTO, A.; LEBLANC, J.G.; CARRERA-SILVA, E.A.; SAVOY DE GIORI, G.; SESMA, F.

San Miguel de Tucuman

Simposio; Simposio Internacional de Biotecnología. II Simposio Argentino-Italiano de Bacterias Lácticas.; 2004

CERELA-CONICET

  La enzima a-galactosidasa (a-Gal), codificada por el gen melA, es la responsable de hidrolizar los enlaces a-1,6 galactósidos presentes en azúcares tales como la estaquiosa y rafinosa. Estos a-galactooligosacáridos (a-GOS) son considerados factores antinutricionales debido a que no son digeridos ni absorbidos en el intestino delgado, provocando efectos fisiológicos indeseables. La importancia de la caracterización genética de la a-Gal radica en la posibilidad de introducirla en bacterias lácticas que colonizan el intestino delgado, para su uso como probiótico. El desarrollo de un microorganismo probiótico con capacidad de degradar los a-GOS in situ resulta una propuesta atractiva y de aplicación biotecnológica en alimentos de origen vegetal. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, evidenciaron elevada actividad a-Gal en Lactobacillus (Lb.) fermentum CRL722. El objetivo de este trabajo fue caracterizar el gen melA que codifica para la enzima a-Gal en L. fermentum CRL 722, y genes relacionados con el metabolismo de galactósidos. En una primera instancia, se identificó la presencia de dicho gen mediante amplificación por PCR empleando cebadores degenerados, e hibridación de ADN-ADN. Diversas técnicas basadas en PCR (PCR inversa, Uneven PCR) permitieron conocer regiones adyacentes al producto obtenido. Empalmando las secuencias logradas se llegó a una región de 3562 pb que contiene genes relacionados al metabolismo de a- y b-galactósidos. Utilizando cebadores divergentes a melA y por la técnica de PCR inversa, se logró identificar el gen rafP (que corresponde a un transportador de rafinosa) en el extremo 5` a dicho gen. Mediante esta misma técnica, se logró amplificar fragmentos contiguos hacia ambos extremos de la secuencia conocida, los cuales han sido secuenciados, y que permiten avanzar hacia el extremo 5´ del gen rafP, a fin de determinar la presencia de posibles reguladores del metabolismo de los a-GOS. MelA de Lb. fermentum CRL722 presenta una alta similaridad con a-Gals de la familia 36 de glicosil hidrolasas. Una característica interesante es que la enzima muestra alta identidad con a-Gals de bacterias termofílicas Gram (+) como Geobacillus stearothermophilus. Estos resultados, también, se refleja en la resistencia térmica de la enzima, lo cual puede ser relevante desde el punto de vista tecnológico.