Caracterización de alfa-galactosidasa e identificación del gen melA de Lactobacillus fermentum CRL 722

LEBLANC, J.G.; SESMA, F.; SAVOY DE GIORI, G.

Tafí del Valle, Tucumán

Jornada; XIX Jornadas Científicas de la Asociación de Biología de Tucumán; 2002

Asociación de Biología de Tucumán

Estaquiosa y rafinosa, a-galactooligosacáridos (a-GOS) presentes en las dietas a base de soja, frecuentemente resisten la digestión y la absorción en el intestino delgado y son fermentados por la microbiota intestinal del intestino grueso. Los productos finales de ese proceso, ácidos grasos de cadena corta (acético, propiónico y butírico) y cantidades considerables de gases (CO2, H2 y CH4), provocan efectos fisiológicos indeseables (hinchazón abdominal, flatulencia, y nauseas) en individuos sensibles. La enzima a-galactosidasa (a-gal) hidroliza los enlaces a-1,6 galactósidos. Por lo tanto, microorganismos con actividad a-gal constituyen una alternativa promisoria para eliminar los a-GOS presentes en soja. Estudios previos, en nuestro laboratorio, pusieron en evidencia que L. fermentum CRL722 posee elevada actividad a-gal. El objetivo de este estudio fue caracterizar la enzima a-gal de L fermentum CRL722 e identificar el gen (melA) que la codifica. La actividad a-gal fue medida en extractos libres de células según la técnica de Church y col. Se determinaron los parámetros cinéticos de la enzima (pH y  temperatura). Para la identificación del gen melA se utilizó la técnica de PCR usando oligonucleótidos cebadores diseñados en base a secuencias conservadas de genes de a-gal de otros microorganismos. a-gal presentó elevada actividad a temperaturas entre 30-50’C y en un rango de pH entre 4,5 y 6,0 lo que demuestra la adaptación de la enzima a las condiciones de crecimiento de los lactobacilos.  Mediante PCR, se amplificó un fragmento único de 550pb. La secuencia de este ultimo mostró 91% de identidad con el gen melA de L. plantarum CRL 8014.   Este fragmento fue utilizado como sonda en hibridaciones de tipo Southern identificándose una banda de 2,8 kpb. Los resultados de este estudio permitieron caracterizar por primera vez la enzima a-gal de L. fermentum CRL722. La secuencia parcial del gen melA y la banda de 2,8 kpb, identificada por Southern, serán utilizadas para lograr la amplificación del gen completo. Posteriormente este gen será introducido en bacterias lácticas que colonizan el intestino delgado para su uso como probióticos in vivo. La posibilidad de desarrollar un microorganismo probiótico con capacidad de degradar los a-GOS in situ resulta una propuesta atractiva, de aplicación biotecnológica.