UTILIZACIÓN DE LC-MS/MS DE ALTA RESOLUCIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

LINGUA, M.; WUNDERLIN D.A.; BARONI, M.V.

Los Cocos

Congreso; I° Congreso Argentino de Espectrometria de Masas; 2012

SAEM

 En los últimos años, los avances en las técnicas analíticas de separación de compuestos y la espectrometría de masas han tenido un impacto cada vez mayor en el estudio de las biomoléculas permitiendo la dilucidación por ejemplo de biomarcadores de enfermedades. En este sentido, la espectrometría de masas en tandem (MS/MS), acoplada a la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), constituyen una de las herramientas analíticas más poderosas para el estudio de las proteínas, permitiendo una identificación rápida y sensible de un pool de estas moléculas. Dicha herramienta combina la habilidad del HPLC para separar especies estructuralmente similares, con la capacidad del MS para dilucidar la estructura de las mismas a partir del patrón de fragmentación generado. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método HPLC-ESI-MS/MS que permita la identificación de proteínas a partir de los espectros MS/MS. Para el desarrollo del método, se utilizó una solución de ABS (Albúmina Sérica Bovina) como estándar, en buffer NH4HCO3 25 mM. Una alícuota de la misma, desnaturalizada mediante tratamiento con DTT (ditiotreitol, agente reductor) y IAA (iodo acetamida, agente alquilante), fue sometida a digestión con Tripsina modificada (Grado Secuenciamiento, Promega) en relación proteasa:proteína de 1:40 p/p durante 16 hs. a 37 °C. La solución resultante de péptidos se diluyó con una solución de ácido fórmico 5% v/v, representando una concentración final de proteína de 5 ug/uL. La separación de los péptidos se realizó utilizando un HPLC (Agilent Technologies) sobre una columna de fase reversa (C18) (2.6 um, 100mm, 2.1 mm i.d.), termostatizada a 40 °C y aplicando un gradiente de solventes (A: ácido fórmico 0,5% v/v; B: ácido fórmico 0,5% v/v en acetonitrilo) a flujo de 0,2 mL/min durante 60 min. El sistema de HPLC se acopló a un espectrómetro de masas (MS) equipado con un cuadrupolo, seguido por un analizador de tiempo de vuelo (microTof-Q II, Bruker). Como interfase se utilizó una fuente del tipo ESI  (ionización por electrospray) operando en modo positivo. Para la identificación de la ABS, se realizó la adquisición de los espectros MS/MS mediante CID (disociación inducida por colisión) en modo automático. A los 40 min. de corrida cromatográfica, se inyectó una solución de formiato de sodio para posterior calibración interna de los espectros de MS/MS. Para el análisis bioinformático de los datos, se realizó MS/MS ion search mediante MASCOT (Matrix Science). Los parámetros de búsqueda en MASCOT se restringieron a péptidos resultantes de una digestión con Tripsina, con hasta dos sitios de clivaje perdidos, carbamidometilación de cisteínas como modificación introducida por IAA y fragmentos con una tolerancia de masas de ±0,3 Da. Finalizado el análisis bioinformático mediante MASCOT, la probabilidad basada en el puntaje de Mowse, arrojó un valor de 48 como puntaje límite a partir del cual se asegura en un 95% la certeza de los resultados obtenidos. Dicho análisis resultó en ABS como la única proteína con el mayor puntaje (912) el cual demostró que el análisis de identificación fue estadísticamente significativo (p<0,05) (Figura 1). Un total de 30 péptidos fueron identificados por comparación de los espectros de MS/MS,  siendo 7 los péptidos identificados con significancia estadística. Estos 30 péptidos identificados permitieron cubrir en un 54% la secuencia completa de la proteína (Figura 2). Nuestros resultados demuestran que la información derivada del análisis bioinformático requiere de un detallado estudio para la correcta comprensión de los resultados. Por otro lado, se evidencia la importancia de la simple adquisición de espectros MS/MS de alta resolución para la identificación de proteínas; la obtención de dichos espectros, sin previo análisis, constituye una fuente de datos fundamental para la identificación de proteínas mediante comparación con secuencias primarias de las mismas presentes en bases de datos.