Optimización de un método para determinar actividad residual de coagulante en queso

BERGAMINI, CARINA; POZZA, LEILA; ZALAZAR, CARLOS; HYNES, ERICA

Concordia, Entre Ríos

Congreso; XII Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de Alimentos; 2009

Asociación Argentina de Tecnólogos Alimentarios

(Presentación en formato póster y publicación del resumen y del artículo completo). Una de las metodologías más recientes para la determinación de la actividad residual de enzima coagulante en queso está basada en la cuantificación de la hidrólisis de un heptapéptido sintético específico de proteasas aspárticas. La reacción se lleva a cabo en un medio de pH controlado incubando el péptido con un extracto de queso por un período de 4 h. La actividad de la enzima se relaciona a la concentración del producto de la reacción que se cuantifica por cromatografía líquida en fase reversa con detección a 300 nm. El objetivo del presente trabajo fue adaptar dicha metodología para su aplicación en queso Reggianito, una matriz alimentaria con baja actividad residual de coagulante. Para ello, se buscó incrementar la sensibilidad de la determinación mediante la modificación de diversos parámetros: longitud de onda de detección, pH de la mezcla de reacción, método de extracción de la muestra y tiempo de reacción. Se obtuvieron los espectros de absorción del péptido y el producto de la hidrólisis, y se estudió la reacción al pH original (3,2) y a pH 4,1, que es más adecuado para la estabilidad y actividad proteolítica de la quimosina. También se compararon dos metodologías para la preparación de la muestra: dispersión en buffer citrato pH 7,0 (método original) y extracción en agua. Finalmente, se estudió la linealidad de la reacción con el tiempo de incubación, con el objetivo de aumentar el tiempo establecido en el método original para lograr una mayor sensibilidad en la detección. Los máximos de absorción del péptido y su producto fueron 280 y 270 nm, respectivamente, por lo que se eligió 270 nm como longitud de onda de detección del producto de la reacción en lugar de 300 nm como proponía el método original. Para seleccionar dicha longitud de onda se verificó que los blancos de muestra y reactivos no presentaban compuestos que se solaparan con los picos de interés. Al comparar los resultados obtenidos a los dos valores de pH ensayados, se observó una mayor velocidad de reacción a pH 4,1, por lo que se seleccionó este pH  para la reacción. Por otro lado, al incubar a pH 3,2 se verificó inestabilidad en la actividad de la quimosina, lo que dio lugar a falta de reproducibilidad de los resultados. La preparación de la muestra con buffer citrato presentó el inconveniente de afectar el pH final de la reacción, por lo que se ensayaron extractos en agua, que, para quesos duros, mostraron una mayor eficiencia en la extracción de la quimosina que el buffer citrato. Finalmente, verificamos la existencia de una relación lineal entre la hidrólisis del péptido y el tiempo de incubación hasta 24 h, tanto al emplear un estándar de quimosina como al ensayar extractos de diferentes tipos de queso; por esta razón, se decidió fijar un tiempo de incubación de 20 h. En el presente trabajo se logró optimizar un método para la determinación de coagulante residual en queso duro por modificaciones en las condiciones de extracción, reacción y detección, que incrementaron la sensibilidad y condujeron a resultados apropiados para los propósitos del análisis.