Caracterización de sistemas CRISPR-Cas en lactobacilos del grupo casei. POSTER

BRIGGILER MARCÓ, M.; PUJATO, S. A.; QUIBERONI, A.; GALLIANI, V.; MERCANTI, D.

Buenos Aires

Congreso; XV Congreso Argentino de Microbiología (CAM 2019); 2019

Asociación Argentina de Microbiología

Introducción y Objetivos: Los sistemas CRISPR (del inglés Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), presentes en genomas de bacterias y arqueas, son arreglos de secuencias de ADN repetitivas, cortas y conservadas (repeticiones), intercaladas con secuencias variables (espaciadores). Estos arreglos se asocian con genes específicos (cas), y en conjunto (sistemas CRISPR-Cas) proporcionan inmunidad específica y heredable contra fagos y plásmidos. Estos sistemas se clasifican de acuerdo con el contenido de genes cas en 6 tipos (I a VI) y varios subtipos. La especificidad de la inmunidad radica en los espaciadores, cuya secuencia corresponde a segmentos de ADN de agentes invasores adquiridos durante contactos previos. Un sistema activo debe poseer genes cas, ya que estos median la adquisición de espaciadores y el proceso efector de la inmunidad. A pesar de la creciente popularidad de CRISPR-Cas como herramienta de edición genómica, se han caracterizado pocos sistemas endógenos. Por ello, el objetivo planteado para este trabajo fue detectar, secuenciar y analizar los sistemas CRISPR-Cas completos presentes en 49 cepas de lactobacilos del grupo casei de la colección del INLAIN. Materiales y Métodos: Con este propósito se diseñaron primers específicos sobre secuencias nucleotídicas conservadas de regiones CRISPR reportadas en genomas de lactobacilos del grupo casei. Utilizando dichos primers, se verificó por PCR la presencia de sistemas de los tipos IIA en 21 cepas (17 Lactobacillus paracasei y 4 Lactobacillus rhamnosus) y IE en una cepa de Lb. paracasei. Los amplicones fueron secuenciados (Macrogen, Corea) y a partir de las secuencias obtenidas se repitieron sucesivamente ciclos de diseño de primers, amplificación y secuenciación, hasta completar los loci CRISPR-Cas. Resultados: El contenido de genes cas para las cepas con sistema tipo IIA fue característico: cas1 y cas2 (universales, presentes en todos los sistemas CRISPR-Cas), csn2 (específicos del tipo IIA) y cas9 (sistemas tipo II). La diversidad de los sistemas CRISPR-Cas se determinó a través de la distribución filogenética de cas1, mientras que la variabilidad entre los sistemas de tipo II encontrados fue evaluada a través de la alineación de cas9. Además, se identificó un tracrRNA homólogo a los encontrados en los sistemas de tipo II, entre los genes cas1 y cas9. Aunque los genes universales fueron conservados, se observó un 22% de polimorfismo de nucleótidos para cas9. Como era de esperar, el contenido de espaciadores fue variable (entre 10 y 26) entre las cepas. La cepa con el sistema tipo IE también presentó un contenido de genes cas característico: cas1 y cas2 (universales), además cas3 y cas6e, los cuales determinan que se trata específicamente de este sistema. Conclusiones: Los sistemas CRISPR-Cas hallados en 21 cepas de Lb. paracasei y Lb. rhamnosus podrían estar activos ya que poseen regiones CRISPR completas. Estudios posteriores de interferencia se utilizarán para confirmar esta hipótesis.