Bacterias lácticas productoras de exopolisacáridos: identificación, optimización de la producción del EPS y evaluación preliminar in vitro e in vivo de su potencial funcional.

PEREZLINDO, M. J.; REINHEIMER, J. A.; BINETTI, A. G.

Corrientes

Jornada; XXI Jornadas Jóvenes Investigadores AUGM; 2013

AUGM

Las bacterias ácido lácticas (BAL) son organismos tradicionalmente reconocidos como seguros (GRAS, por su sigla en inglés) y poseen una larga historia de utilización en el procesamiento de numerosos alimentos siendo capaces, en algunos casos, de producir ciertos polímeros de carbohidratos conocidos como exopolisacáridos (EPSs). Estos polisacáridos pueden permanecer fuertemente asociados a la superficie celular (polisacáridos capsulares), o pueden ser excretados al medio ambiente, dando lugar a los conocidos como EPSs ?slime? o filantes, que modifican la textura y consistencia del medio al cual se excretan y, por esta razón, son de gran utilidad en la industria de alimentos (ciertos quesos y leches fermentadas, principalmente). A pesar de que la capacidad de las BAL de sintetizar EPSs está muy difundida en la naturaleza, el rol fisiológico de estas moléculas aún no ha sido claramente establecido. La composición química de algunos EPSs se asemeja a la de los carbohidratos prebióticos, definidos como ?ingredientes alimentarios no digeribles que afectan beneficiosamente la salud del consumidor, estimulando selectivamente el desarrollo y/o la actividad de uno o varias especies bacterianas residentes del colon. De este modo, los EPSs serían compuestos aptos para ser fermentados por la microbiota beneficiosa del tracto gastrointestinal, ejerciendo un rol prebiótico. El objetivo de este trabajo fue identificar y evaluar la diversidad genética de cepas autóctonas de Lactobacillus productoras de EPS, optimizar las condiciones de obtención de los mismos y evaluar preliminarmente su funcionalidad in vitro e in vivo. Se utilizaron cepas de lactobacilos homo y heterofermentantes, todas pertenecientes a la colección del INLAIN, aisladas de fermentos naturales y como alterantes de quesos. Las cepas fueron desarrolladas rutinariamente en caldo MRS (Biokar, Argentina) y en leche 10 % (p/v) en aerobiosis, a 37°C. Las cepas fueron identificadas por secuenciación del gen 16SrDNA y comparación de las secuencias con las disponibles en bases de datos. Para evaluar su diversidad genética, se realizaron reacciones RAPD-PCR independientes con 4 primers al azar, analizando los perfiles con el programa estadístico Applied Maths (Bélgica). Por otro lado, se determinaron las cinéticas de desarrollo de las cepas a 37°C en caldo MRS y leche y, a intervalos regulares, se midió la densidad óptica a 560 nm o el pH y el recuento celular (agar MRS, 24 h, 37°C). Una vez determinadas las fases de desarrollo, se realizó la extracción de EPS crudo en la fase estacionaria temprana de los cultivos a pH libre (MRSm para de Lactobacillus fermentum y leche para Lactobacillus helveticus). En todos los casos se obtuvo un rendimiento de EPS crudo que osciló entre ?. y ?.. mg/l de cultivo. Para el caso de la cepa Lactobacillus fermentum Lf2, se evaluó asimismo la producción de EPS a pH controlado (fermentador de 2 l, pH 6,0 y 5,0), verificándose un rendimiento superior a 300 mg/l, en ambas condiciones. Para evaluar el potencial prebiótico de estos compuestos, se determinó su capacidad para estimular in vitro el desarrollo Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1, mediante mediciones de densidad óptica de cultivos overnight, en relación a un control. A los fines de evaluar su potencial funcional in vivo, una solución de EPS crudo producido por L. fermentum Lf2, seleccionado de acuerdo a ensayos in vitro, fue suministrado por intubación gástrica (100 mg/kg/día) a ratones Balb/c hembras de 6 semanas de edad, durante 2, 5, 7 días. Al final de cada período de alimentación, se determinó la seguridad del EPS por ensayo de traslocación en hígado y se evaluó el nivel de IgA secretoria (en suero sanguíneo) mediante la técnica de ELISA como indicador de la capacidad de estimular la respuesta inmune. Las cepas seleccionadas fueron exitosamente identificadas como L. fermentum Lf2, Lf16 y QP1 y L. helveticus 67 y se pudieron definir condiciones adecuadas para el aislamiento de los EPSs que producen. A partir del ensayo de funcionalidad realizado, se puede establecer que los EPSs producidos por todas las cepas poseen, in vitro, un rol prebiótico, resultando potencialmente útiles para su inclusión como aditivo alimentarios en la elaboración de quesos y leches fermentadas. La administración del EPS crudo producido por L. fermentum Lf2 resultó segura (no se observó translocación en hígado) para la dosis y el período de administración ensayados. Sin embargo, bajo estas condiciones experimentales, no se observó capacidad de estimular la respuesta inmune, al menos a nivel de IgA en suero sanguíneo (no se observaron diferencias significativas en la concentración de IgA-s entre los grupos tratados con EPS y el grupo control). Posiblemente se podría evidenciar una respuesta inmunológica a nivel de IgAs en contenido instestinal y citoquinas en tejido intestinal (ensayo a realizar a futuro). Asimismo, en un futuro cercano se plantea la necesidad de evaluar in vivo el rol prebiótico de este EPS (mediante ensayos de qPCR) así como sus propiedades reológicas y tecnológicas (mediante su incorporación como aditivo funcional a una leche fermentada).Palabras claves: Bacterias Acido Láctico ? EPS ? funcionalidad