Efecto de las sales sobre la estabilidad química y física de la enzima beta-galactosidasa en sistemas deshidratados de trehalosa

SANTAGAPITA, PATRICIO R.; BUERA, M. PILAR

Puerto Vallarta, Jalisco, México

Congreso; V Congreso Iberoamericano de Ingeniería en Alimentos (CIBIA V); 2005

p;amp;lt;!-- /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";} @page Section1 {size:595.3pt 841.9pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:35.4pt; mso-footer-margin:35.4pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} /* List Definitions */ @list l0 {mso-list-id:89400578; mso-list-type:simple; mso-list-template-ids:33322552;} @list l0:level1 {mso-level-tab-stop:18.0pt; mso-level-number-position:left; margin-left:18.0pt; text-indent:-18.0pt; font-family:"Times New Roman";} ol {margin-bottom:0cm;} ul {margin-bottom:0cm;} --&amIntroducción. Muchos compuestos polioxhidrílicos se emplean como excipientes para proteger biomoléculas sometidas a deshidratación. Entre ellos, el azúcar trehalosa tiene un efecto protector especial sobre la estabilidad de biomoléculas, que no se explica solamente por su propiedad de generar vidrios, si no que las interacciones intermoleculares azúcar-biomolécula -dada la capacidad de los sacáridos de generar uniones por puente de hidrógeno- tienen un papel importante (1). Por otro lado, se sabe que las sales afectan la cinética de reacciones de deterioro (reacción de Maillard y oxidaciones) y las de hidrólisis y cristalización de azúcares. La cristalización de las matrices protectoras en que se deshidratan estructuras lábiles conduce a la pérdida de estabilidad de las biomoléculas (2). El propósito del presente trabajo es estudiar el efecto de ciertas sales sobre las propiedades físicas y químicas del disacárido trehalosa, fundamentales para determinar la estabilidad de biomoléculas sometidas a condiciones extremas de temperatura y disponibilidad de agua en dichos medios. Las principales reacciones estudiadas serán la estabilidad enzimática, la reacción de Maillard (reacción entre azúcares reductores y grupos NH2) y la hidrólisis y la cristalización de los azúcares. La comprensión de los efectos de las sales y su relación con la estabilidad de biomoléculas tendría impacto en la producción de aditivos e ingredientes alimentarios, enzimas y productos farmacéuticos tanto para la formulación de los preparados como para la selección de las condiciones de producción y almacenamiento.Metodología. Las matrices contenían 20 % p/v de trehalosa, 0,7 U.E./g de matriz de la enzima b-galactosidasa de Aspergillus oryzae y alguna de las siguientes sales: citrato de K, acetato de K y de Mg, MgCl2 y KCl, todas en relación molar 5: 1 Az.: Sal. Las matrices deshidratadas fueron obtenidas por liofilización durante 48 h en un liofilizador Heto Holten A/S, (Heto Lab Equipment, Denmark). Luego los sistemas fueron re-humidificados durante 7 días en atmósferas de presión relativa de 22 % (solución saturada de CH3COOK) y 44 % (K2CO3). Los sistemas fueron sometidos a un tratamiento térmico a 70°C ± 2ºC en estufa de circulación forzada de aire. Las variables analizadas fueron: contenido de agua, grado de pardeo no enzimático, cantidad de monosacárido libre y actividad enzimática. Asimismo se completaron los estudios con la determinación de las transiciones térmicas por DSC Mettler 822 y la observación de los sistemas con microscopio (Leitz Wetzlar, modelo Dialux, Alemania) con luz polarizada a 160 X. Resultados y discusión. Mantener la estructura nativa es un factor crítico para la correcta actividad de la enzima. La matriz de trehalosa protege a la enzima en estado deshidratado, permitiéndole al ser resuspendida, mantener la actividad. Los resultados mostraron que es importante para una efectiva protección de la enzima que el sistema esté en un estado no cristalino (por lo que la mayoría de las muestras que cristalizaron a actividad de agua (aw) 0,43 no pudieron proteger a la enzima, con un rápido descenso en la actividad) pero que éste no es el único requisito para mantener la actividad. En comparación con el resto de las muestras analizadas, en los sistemas que contenían citrato de K no hubo aumento en el contenido de agua y la cristalización fue inhibida.  Así mismo, la hidrólisis del azúcar y la reacción de Maillard se mantuvieron en un grado intermedio. Esta combinación de eventos produjo que la retención de actividad enzimática se conservara mejor que en el resto de los sistemas estudiados. El acetato de Mg fue la sal que más aceleró la pérdida de glucosa y el pardeo, y que si bien retrasó la cristalización del azúcar, la actividad enzimática remanente obtenida fue baja. Paradójico es el caso del MgCl2, debido a que produjo retraso de la cristalización del azúcar y de la reacción de Maillard, y un bajo nivel de hidrólisis, pero tuvo escasa retención en la actividad enzimática. El acetato de K mejoró la retención de actividad enzimática hasta las 60 h, aproximadamente; sin embargo, aumento la cristalización del sistema (aunque no del azúcar), se pardeo en forma intermedia, y no aumento el contenido de agua del sistema (0,22). Las correlaciones realizadas entre los diferentes parámetros en estudio mostraron que las reacciones de hidrólisis y pardeamiento estuvieron correlacionadas entre sí, y que la actividad enzimática únicamente correlacionó con el contenido de agua del sistema. Conclusiones. Existe un delicado compromiso entre las reacciones de hidrólisis de la trehalosa, la reacción de Maillard, la cristalización de las matrices y el contenido de agua. Del compromiso entre todas las interacciones mencionadas surge que los sistemas en los que la enzima resultó mejor protegida fueron los que contenían citrato de K. Es posible que su efecto estabilizante del pH pueda haber influido en este fenómeno, dado que lo mantuvo estable y en un valor elevado. Agradecimientos. UBA (X226), CONICET (PIP 02734).  Bibliografía.  1.  Carpenter, J.F., Crowe, L.M., Crowe, J.H. (1987) Biochem Biophys Acta 923: 109-115. 2. Longinotti, M.P., Mazzobre, M.F., Buera, M.P., Corti, H.R. (2002) Phys. Chem. Chem. Phys. 4: 533-540.