CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

En la formulación de matrices para la conservación de biomoléculas frecuentemente se emplean combinaciones de sacáridos, debido a que las interacciones a través de puentes hidrógeno tienen un efecto estabilizante sobre las mismas. El efecto protector de los sacáridos depende por lo tanto de su capacidad para generar dichas interacciones: mientras que en sistemas liofilizados la trehalosa protege a las enzimas, las beta-ciclodextrinas (beta-CD) ofrecen escasa protección, a pesar de que ambos están constituidos por unidades de glucosa. El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto de las modificaciones de la beta-CD a través de su polimerización (poli-beta-CD) y/o posterior carboximetilación (CM-poli-beta-CD) [1], sobre la estabilidad enzimática, en sistemas liofilizados. Se liofilizaron soluciones de 10% de trehalosa (T) o polímero (beta-CD, poli-beta-CD, CM-poli-beta-CD -con 40% de grado de carboximetilación-) y sus combinaciones con trehalosa, conteniendo la enzima beta-fructofuranosidasa (invertasa) de S. cerevisiae. Luego de la liofilización, los sistemas se equilibraron a actividades de agua (aw) de 0,22 y 0,43 a 25°C. Posteriormente se realizó un tratamiento térmico a 87°C y se analizaron la actividad enzimática, las transiciones térmicas de los sistemas (Tg y fusiones) y se obtuvieron imágenes de las matrices por microscopía de fuerza atómica. Durante la liofilización la trehalosa confirió la mayor protección a la invertasa (se recuperó casi 100% de actividad); mientras que en poli-beta-CD se recuperaron niveles superiores al 85 % de la actividad enzimática, en beta-CD y CM-poli-beta-CD estos fueron menores que 50 y 20%, respectivamente. Los aditivos más efectivos en conferir protección durante el tratamiento térmico fueron poli-beta-CD (con y sin T) y beta-CD+T. beta-CD no fue un aditivo efectivo para proteger la enzima por su alta insolubilidad. Mediante su polimerización se logró mejorar sus características hidrofílicas, aumentando su solubilidad y su capacidad de interactuar con la enzima. Al carboximetilarlo, en cambio, se redujo su capacidad de generar puentes H y no se comportó como agente protector. El agregado de trehalosa a la matriz beta-CD tuvo un efecto sinérgico: la beta-CD retrasó/inhibió la cristalización de trehalosa y ésta mejoró la solubilidad de beta-CD, previniendo así la desnaturalización proteica protegiendo regiones hidrofóbicas de la proteína. Referencias [1] Villalonga M.L., Reyes G., Fragoso A., Cao R., Fernandez L., Villalonga R., Biotechnol. Appl. Biochem. 2005, 41, 217-223. Agradecimientos: se agradece a la SECyT el subsidio recibido para la colaboración con la Universidad de Matanzas (Proyecto CU/PA 04-EVI/037).

enviar mensaje