Desarrollo de biomasa y método de detección de Escherichia coli Nissle 1917 para su utilización en un ensayo in vivo

ROMERO SCHARPEN, A.; BERISVIL, A.P.; ZBRUN, M.V.; ROSSLER, E.; FUSARI, M.L.; BLAJMAN J.E.; LORENZÓN, G.; FUHR, E.; ASTESANA, D.M.; SIGNORINI, M.L.; MARTI, L.E.; ROSMINI, M.R.; ZIMMERMANN, J.A.; SOTO, L.P.; SEQUEIRA, G.J.; FRIZZO, L.S.

Casilda

Jornada; XVII Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2016 - IV Jornada Latinoamericana Facultad de Ciencias Veterinarias; 2016

Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de Rosario

Escherichiacoli Nissle 1917 (EcN, serotipo O6:K5:H1) es una cepa que puede habitar eltracto gastrointestinal de humanos y animales, sin provocarle daño alguno. Hasido usada como agente probiótico para tratar infecciones gastrointestinaleshumanas desde 1920. Esta cepa carece de los genes de virulencia presentes enotras cepas de E. coli y es mucho más eficiente en la colonización delintestino humano, debido a sus fimbrias tipo F1C (2). EcN presenta actividadantagónica in vitro contra Salmonella spp., Shigella ssp., algunosenteropatógenos como E. coli, Proteus spp. y Candida spp. También se conoce quedesplaza a E. coli, Salmonella typhimurium y Candida albicans in vivo. Ademásla cepa estimula la respuesta inmune contra infecciones bacterianas y fúngicasin vivo (4). Esta bacteria ha sido evaluada contra la diarrea neonatal enterneros en Alemania, observándose una reducción significativa. Estos estudiosderivaron en la comercialización de la cepa bajo el nombre de Ponsocol®. Aunqueeste producto está disponible para veterinarios y productores como una droga deprofilaxis para diarreas neonatales en Alemania, no es comercializado ennuestro país. Ante la falta de investigación de los efectos de este probióticoen terneros en Argentina, se planteó la realización de un ensayo in vivo dondeestos animales serán alimentados con leche en alimentadores automáticos. Estamisma leche se utilizará para hacer crecer el microorganismo probiótico yevaluar sus efectos, haciendo el proceso más económico, al evitar lafermentación previa. El uso de alimentadores automáticos en el ensayo in vivopermitirá no solo ajustar, sino conocer los consumos individuales de losterneros, tanto de leche fermentada con probióticos como del alimento sólido.Además, se requiere de una técnica de monitoreo de la cepa, luego del paso porel tracto gastrointestinal. Aunque los métodos microbiológicos convencionales talescomo métodos bioquímicos, fenotípicos y genotípicos para la identificación sonfiables, se requieren varios días para obtener un resultado. El uso de la PCRimplica ahorro de tiempo y se considera un método sensible para la detección deespecies microbianas. En el caso de EcN la técnica más utilizada es la diseñadapor Blum-Oehler y col. (2003) (1). Esta herramienta no solo permite identificarla cepa a partir de cultivos puros, sino también desde muestras complejas. EstaPCR múltiple amplifica segmentos de pequeños plásmidos estables presentes enEcN que codifican para una proteína de membrana que interviene en lamovilización, siendo específica para esta bacteria. El objetivo de este trabajofue evaluar el crecimiento de EcN en leche y determinar la capacidad dediscriminación de un método de detección específico para EcN. Para lograr losobjetivos, EcN se reactivó en Eosin Methylen Blue agar (EMB) y se incubó a 37ºCdurante 24 h. Una colonia de esta placa se repicó a un tubo con 9 ml de lecheen polvo estéril (120g/l, pH 7,01). Este tubo se incubó a 37ºC durante 24 h enaerobiosis. EcN fermentó la leche (pH 5,40), obteniéndose una consistenciasimilar al yogurt a las 18 h de incubación. Se realizaron diluciones decimalesseriadas en Ringer ¼ y se sembraron 6 placas en profundidad y 6 placas ensuperficie de Violet Red Bile Lactose agar (VRBL). Tres placas sembradas enprofundidad y 3 en superficie se incubaron a 37ºC y las otras 6 placas a 44ºCdurante 24 h. Se obtuvieron 8,7 y 8,8 logaritmos en las placas sembradas enprofundidad y 8,7 y 8,9 en las placas sembradas en superficie incubadas a 37ºCy 44ºC respectivamente. Para poder ejercer su efecto, se debería administrar almenos 1 x 108 UFC/ml de este microorganismo viable (4). Según Sezonov et al. (2007)(3)esta bacteria crece 5x107 UFC/ml en medios líquidos comerciales específicos(caldo Luria Bertani). Macroscópicamente, en las placas sembradas enprofundidad se observaron dos tipos de colonias (violetas pequeñas y rosadasmás grandes), lo que pudo deberse a que algunas colonias crecieron a mayorprofundidad que otras. En las placas sembradas en superficie las coloniascrecieron uniformemente. Las colonias crecidas en superficie fueronidentificadas por PCR. Para esto, se extrajo ADN por hervido (10 min a 100ºC).Se utilizaron tres pares de primers: MUTA 5 y MUTA6 (dirigidos a una región nocodificante del plásmido pMUT1 -entre 1934 y 2276-, generando un producto de361 pares de bases), MUTA 7 y MUTA 8 (región no codificante entre los genesmobA y repA -5302 y 4888-, generando un producto de 427 pb) y MUTA9 y MUTA 10(región blanco mobBD -46 y 340-, producto de 313 pb). El programa de cicladoutilizado fue un paso de desnaturalización de 3 min a 95ºC, seguido de 35ciclos de tres pasos de 45s cada uno a 95ºC (desnaturalización), 60ºC(annealing) y 72ºC (extensión). Por último la extensión final fue de 3 min a72ºC. Los productos de esta PCR fueron sometidos a una electroforesis en gel deagarosa al 1%. Se utilizaron controles negativos (E. coli aislada desde sangre,Salmonella spp. y Lactobacillus spp.). La presencia de los tres productos dePCR en el gel confirmó la identidad de EcN. Los controles negativos nogeneraron productos de PCR apreciables en el gel de agarosa. Se concluye que laleche en polvo es una buena matriz para el crecimiento de esta bacteriaprobiótica, por lo que en un futuro será utilizada para la producción debiomasa. A la vez se observó un mejor crecimiento de la cepa cuando es sembradaen superficie y a 44 ºC por lo que se utilizarán estas condiciones alrecuperarla durante el ensayo in vivo. El método de detección evaluado seráutilizado para discriminar la presencia de EcN a partir de la materia fecal delos terneros suplementados.