Monitoreo de la cepa Lactobacillus salivarius DSPV 001P mediante tinción con isotiocianato de fluoresceína

BLAJMAN J.E.; ROMERO SCHARPEN, A.; ASTESANA, D.M.; ZIMMERMANN, J.A.; ROSSLER, E.; BERISVIL, A.P.; FUSARI, M.L.; ROSMINI, M.R.; ZBRUN, M.V.; SOTO, L.P.; FRIZZO, L.S.

Esperanza

Jornada; III Jornadas de Difusión de la Investigación y Extensión; 2015

El conocimiento relacionado al destino de las bacteriasprobióticas dentro del ambiente complejo de la microbiota intestinal es muyescaso y el estudio de la distribución de estas bacterias in vivo representa ungran desafío. La localización y desplazamiento de los probióticos durante sutránsito por el tracto gastrointestinal (TGI) de los pollos, así como suinteracción con el sistema inmune del huésped o con la microbiota indígena hancomenzado a ser estudiados, pero aún no están bien entendidos4. Los mecanismosparecen ser complejos y varían entre diferentes preparaciones probióticas. Lautilización de herramientas de monitoreo de las cepas probióticas in vivopodría contribuir al entendimiento del mecanismo de acción de estas bacteriasrelacionando la localización y la carga microbiana con la generación de mejorasen el estado sanitario y la performance de crecimiento de los animales durantela crianza intensiva. El objetivo del ensayo fue monitorear la cepaLactobacillus salivarius DSPV 001P mediante tinción con isotiocianato defluoresceína tras su administración a pollos parrilleros. Para el ensayo seutilizó la cepa bacteriana de origen aviar L. salivarius DSPV 001P conpropiedades probióticas in vitro. El cultivo fresco de la cepa seleccionada fuecentrifugado a 5000 xg durante 10 min y lavado 2 veces con buffer PBS a pH 7,2.El sedimento fue resuspendido con PBS, adicionado de isotiocianato defluoresceína (FITC) (1mg/ml, Sigma) e incubado durante 2 h a 37ºC en laoscuridad4. Posteriormente, los cultivos fueron centrifugados y lavados 6 vecescon buffer PBS hasta la eliminación completa del agente fluorescente. El pelletfue resuspendido en PBS a una concentración final de 1010 UFC/ml. Fueronutilizados 45 pollos parrilleros recién nacidos (en su 1er día de vida). Lospollos fueron divididos en cinco grupos experimentales (cuatro grupos tratadosy un grupo control) conformados por nueve animales cada uno. Cada grupo recibió1 ml de la bacteria fluorescente per os en diferente concentración: 10 Log UFC,9,5 Log UFC, 8,5 Log UFC y 7,5 Log UFC. Al grupo control se le suministró 1 mlde PBS como placebo. El cuidado de los animales se realizó teniendo en cuentala Guía para el cuidado y uso de animales en investigación y enseñanza2. Necropsiasprogramadas fueron realizadas a tres pollos de cada grupo experimental (15pollos totales), sacrificados mediante dislocación cervical, a tres tiemposdiferentes post administración del probiótico: 30 min, 6 h y 12 h. Serecogieron los siguientes órganos: hígado, páncreas, buche, duodeno, ciego ybolsa de Fabricio utilizando instrumental estéril en cada tejido para minimizarla posibilidad de contaminación bacteriana entre muestras. Los órganos fueronprocesados mediante la técnica histológica de Saint Marie3, con algunasmodificaciones. El montaje se realizó con bálsamo de Canadá. El monitoreo y lainteracción de las bacterias marcadas con FITC se estudió bajo luz azul en unmicroscopio de fluorescencia (400 X) (Eclipse CI, Nikon). Las imágenes fueron tomadascon una cámara fotográfica digital (DCM900, ScopeTek) empleando el software decaptura Minisee versión 1.1.3.0 para Windows. Luego de 30 min del suministro delas bacterias marcadas fluorescentes se observaron ?clusters? o agregados debacterias recorriendo el lumen de buche, duodeno y ciego. Se distinguieronbacterias marcadas en la túnica mucosa y submucosa del buche de los pollos. Enduodeno, agregados de bacterias fueron hallados en las vellosidadesintestinales, en íntimo contacto con las células epiteliales que las recubren.Se observaron también bacterias marcadas internalizadas en la lámina propia yen la muscular de la mucosa. Una mayor cantidad de agregados bacterianos pudoobservarse en los pollos que recibieron 10 y 9,5 Log UFC. Agregados máspequeños y bacterias aisladas fueron visualizados en aquellos animales querecibieron 8,5 y 7,5 Log UFC. Pequeños agregados bacterianos fueron detectadosen los ciegos de los pollos que habían recibido 10 Log UFC de L. salivariusDSPV 001P. En tanto, solo bacterias fluorescentes dispersas se encontraron enlos ciegos de los pollos que habían recibido 9,5 Log UFC de L. salivarius DSPV001P y no se observaron bacterias en los ciegos de las aves que habíanconsumido una concentración bacteriana inferior. No se encontraron bacterias enla bolsa de Fabricio. Hubo ausencia de translocación bacteriana a hígado ypáncreas en los pollos tratados. No se hallaron bacterias marcadas en lospollos controles. Luego de 6h y 12h post-administración de las bacterias marcadas,se evidenciaron pequeños agregados bacterianos en el lumen de buche y escasasbacterias en duodeno. Se vislumbraron ?clusters? de bacterias en la mucosa,submucosa y muscular del ciego de todos los pollos. Además, se observaronbacterias en la bolsa de Fabricio de los pollos que recibieron 10 y 9,5 LogUFC. Hubo ausencia de translocación bacteriana a hígado y páncreas en lospollos tratados. No se hallaron bacterias marcadas en los pollos controles. Latinción con FITC permitió efectuar de manera sencilla y rápida el monitoreo deL. salivarius DSPV 001P durante el tránsito gastrointestinal de pollosparrilleros. En este trabajo pudimos corroborar la ausencia de translocación deL. salivarius DSPV 001P al hígado y páncreas de los pollos, siendo este parámetrocomúnmente utilizado para evaluar un candidato probiótico pues resultainteresante como criterio de seguridad. La existencia de bacterias marcadas enla bolsa de Fabricio indica la capacidad de interacción de la cepa en estudiocon las células del sistema inmune. La presencia de bacterias fluorescentes eníntimo contacto con las células epiteliales de las vellosidades intestinales einternalizadas señala la colonización de la cepa L. salivarius DSPV 001P en elTGI de los pollos en estudio.