Monitoreo de la cepa Lactobacillus salivarius DSPV 001P de origen aviar por Electroforesis en Gel por Campos Pulsados

BLAJMAN J.E.; BERISVIL, A.P.; ROMERO SCHARPEN, A.; ASTESANA, D.M.; ZIMMERMANN, J.A.; CONTI, G.B.; ROSMINI, M.R.; ZBRUN, M.V.; SEQUEIRA, G.J.; FRIZZO, L.S.

Casilda, Santa Fe

Jornada; XVI Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2015 ? III Jornada Latinoamericana; 2015

Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional de Rosario

El conocimiento relacionado a la localización de lasbacterias probióticas dentro del ambiente complejo de la microbiota intestinales muy escaso y el monitoreo de estas bacterias in vivo representa un gran desafío.La técnica de Electroforesis en Gel por Campos Pulsados (PFGE) es consideradaactualmente el ?gold standard? de los métodos de tipificación molecular. Estatécnica permite  tipificar  cepas de  la misma  especie, para  así  poder determinar diferencias genéticas  entre  ellas por medio  de  la digestión  y  separación de fragmentos de ADN1. Esteexperimento fue diseñado con la finalidad de comprobar si la cepapotencialmente probiótica Lactobacillus salivarius DSPV 001P administrada apollos parrilleros presentaba diferencias con la que posteriormente serecuperaba desde el tracto gastrointestinal. Para obtener el perfil genómico detodas las cepas (L. salivarius DSPV 001P identificada, L. salivarius DSPV 001Pliofilizada, L. salivarius DSPV 001P recuperada desde buche y L. salivariusDSPV 001P recuperada desde ciego) se usó la metodología basada en PFGE. Unaalícuota de un cultivo overnight de cada una de las cepas fue transferida a unvolumen de 4 ml de caldo MRS y posteriormente incubada a 37 ºC durante 18 h enanaerobiosis. Los cultivos fueron centrifugados durante 5 min a 5000 g. Elsobrenadante fue descartado y el sedimento resuspendido en 1,8 ml de NaCl0,85%. La densidad óptica (DO) de las suspensiones celulares fue ajustada a DO2,0. La agarosa de bajo punto de fusión al 2% (Pulsed Field Certified Agarose,Bio-Rad®) fue calentada en el microondas a potencia baja y mantenida en bañotermostatizado a 55 ºC. Un volumen de 150 µl de agarosa fundida fue adicionadoa 150 µl de suspensión celular. Inmediatamente, la mezcla fue dispensada en lospocillos del molde para plugs, evitando la formación de burbujas. Se prepararondos plugs por muestra, los cuales se dejaron solidificar en la heladera (4 ºC)por 5 min. Los moldes se abrieron y los plugs fueron transferidos con unaespátula a tubos falcon conteniendo buffer NET con lisozima (10mg/ml) (Fluka®).Los tubos fueron colocados en una gradilla e incubados en un bañotermostatizado a 37 ºC por 24 h. Seguidamente, cada plug se transfirió a untubo falcon con buffer de lisis 50 mM Tris pH 8,50 mM ácidoetildiaminotetraacético (EDTA), 1% Lauril sarcosina sódica pH 7,6 y 0,5 mg/mlde Proteinasa K (Promega® ? Madison, USA) y se incubó a 37 °C durante 24 h.Luego, los tubos fueron retirados del baño termostatizado y el buffer de lisisdescartado cuidadosamente. Para los lavados, se añadió 10 ml de bufferTris-EDTA (TE) estéril (Tris 10mM; EDTA 1 mM, pH 8,0), dejándose en bañotermostatizado a 55 ºC por 40 min (este paso de lavado se repitió en cuatro ocasiones)2.Finalmente, los plugs se trasladaron a microtubos con 2 ml de buffer TE 1Xestéril, y se mantuvieron a 4 ºC hasta su utilización posterior. Para ladigestión enzimática se realizó una dilución del buffer de la enzima 10X conagua de calidad molecular y la enzima de restricción SmaI. El ADN bacterianoque estaba dentro del plug fue digerido con la enzima de restricción SmaIutilizando una concentración de 15 unidades de enzima por plug y un tiempo deincubación de 5 h a 25 °C. Los fragmentos de ADN digeridos dentro de los plugsfueron separados mediante PFGE en un gel de agarosa al 2% en buffer TBE 0,5X(Tris-Borato-EDTA). Una vez solidificado el gel, se incorporó cada muestra enuna calle diferente y se aplicó encima una capa de agarosa al 2% como sellador.La electroforesis se llevó a cabo en un equipo de electroforesis en campopulsado CHEF-DR III (Bio-Rad) con buffer TBE 0,5X bajo las siguientescondiciones: 6 V/cm (cambio de orientación inicial 5 s, cambio de orientaciónfinal 35 s) durante 18 h a 14 °C. Después de la electroforesis, los gelesfueron teñidos 30 min en bromuro de etidio (10 mg/mL). La imagen fue capturaday finalmente guardada para su interpretación posterior. El coeficiente desimilitud entre L. salivarius DSPV 001P identificada, L. salivarius DSPV 001Pliofilizada, L. salivarius DSPV 001P recuperada de buche y L. salivarius DSPV001P recuperada de ciego fue del 100%. Todas las muestras presentaron unidéntico patrón de restricción, en tamaño y número de fragmentos. Enconclusión, la técnica PFGE permitió inferir que todos los aislamientos teníanla misma procedencia, y es una técnica adecuada para el monitoreo in vivo decepas probióticas, ya que posee alto poder discriminatorio, sus resultados sonreproducibles y es de rápida ejecución y comparación.