Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas integrantes de la microbiota intestinal de terneros jóvenes

SOTO, L.P.; FRIZZO, L.S.; BERTOZZI, E.; AVATANEO, E.; MARTÍ, L.E.; SEQUEIRA, G.J.; ROSMINI, M. R.

Casilda, Santa Fe

Jornada; IX Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2008; 2008

Facultad de Ciencias Veterinarias-Universidad Nacional de Rosario

Los animales sanos poseen en su tracto gastrointestinal una microbiota típica que después de la colonización durante los primeros días de vida, alcanza un estado de simbiosis. Los lactobacilos son componentes habituales de la flora intestinal normal tanto en el hombre como en los animales, y en el caso de los terneros han sido considerados como posibles responsables del control de los efectos de los gérmenes patógenos como Salmonella spp. y Escherichia coli. La crianza de terneros, en sistemas intensivos que los separan de sus madres a temprana edad, dificulta la colonización de la microbiota intestinal indígena, en especial la proveniente del contacto materno, y facilita la actividad de microorganismos patógenos. En las últimas décadas, se han estudiado los beneficios de la microbiota indígena con capacidad probiótica para inhibir el desarrollo de bacterias patógenas en terneros como alternativa al uso profiláctico de los antibióticos2. La administración periódica de un inóculo probiótico de origen bovino favorecería el establecimiento de una flora intestinal más estable y equilibrada, la cual, mejoraría la salud de los terneros. Por otro lado, considerando la propiedad de especie-especificidad, es más factible la adherencia a las células intestinales si la cepa es administrada en la misma especie animal de donde fue aislada. Aunque la diversidad de la microbiota intestinal ha sido estudiada extensamente por técnicas de cultivo, las técnicas moleculares tienen renovado interés, especialmente las que utilizan el 16S rDNA3, por la gran disponibilidad de secuencias en las diferentes bases de datos. El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar diferentes especies de bacterias ácido lácticas integrantes de la microbiota intestinal de terneros jóvenes. Los aislamientos se realizaron a partir de la mucosa de ciego y yeyuno de terneros lactantes, para lo cual se utilizó el medio selectivo LAMVAB para Lactobacillus. Las colonias seleccionadas fueron multiplicadas en caldo MRS durante 24 h a 37º C y se conservaron en glicerol al 25% v/v a ?80 ºC. Para el aislamiento de ADN, 2 ml de cada cultivo en crecimiento fue centrifugado a 14000g (5 min). El sedimento fue dispuesto a ?20 ºC durante 24h para facilitar la rotura de las células. El ADN fue extraído según Marmur (1961)4, resuspendido en 50 μl de buffer TE y 5 μl fueron agregados directamente al tubo de PCR. La integridad del ADN fue visualizada por electroforesis en gel de agarosa al 0,7%. El gen 16S rDNA de cada aislamiento fue amplificado por PCR usando los primers 27F y 1492R, produciendo fragmentos de aproximadamente 1,5 Kpb. Cada tubo de reacción (50 μl) contenía: 10 μl 5X PCR buffer para Taq polimerasa, 1,5 mM MgCl2, 200 μM de cada dNTP, 0,4 μM de cada primer y 2U de Taq polimerasa. El programa para el termociclador fue el siguiente: 94 ºC durante 5 min; 30 ciclos de 94 ºC durante 1 min, 55 ºC durante 1 min y 72 ºC durante 1 min. Finalmente un paso de extensión a 72 ºC durante 7 min. Luego de la reacción, los productos de PCR fueron detectados por electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v el cual fue teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. Tales fragmentos fueron secuenciados y alineados con las secuencias depositadas en la base de datos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)1. Se aislaron 13 cepas de ciego: 2 Enterococcus hirae, 1 Lactobacillus mucosae, 8 L. salivarius, 1 L. ruminis y 1 Pediococcus acidilactici; y 5 cepas en yeyuno: 1 P. acidilactici, 1 Weissella paramesenteroides, 1 L. curvatus, 1 L. pentosus y 1 L. arizonensis. Los porcentajes de identidad obtenidos entre dichas cepas y las secuencias alineadas del GenBank fueron del 89 al 99%. Los lactobacilos presentes en el tracto gastrointestinal de los terneros se encuentran distribuidos en el medio ambiente, plantas, suelo, agua y en los productos elaborados a base de cereales y en los silos, así como también en el tracto gastrointestinal de humanos y otras especies animales. Muchas de estas cepas han sido estudiadas en cuanto a sus propiedades probióticas y han sido utilizadas como aditivos alimentarios. La amplificación y secuenciación del gen 16S rDNA ha sido una técnica exitosa para la identificación y diferenciación de las distintas especies de Lactobacillus de origen bovino. Dichas cepas serán estudiadas en cuanto a sus capacidades probióticas para ser administradas a terneros lactantes criados artificialmente con el fin de mejorar el balance de la microbiota benéfica adquirida naturalmente.