Aislamiento de ADN a partir de materia fecal de terneros lactantes para la obtención de amplicones del 16s rRNA del ecosistema bacteriano

SOTO, L.P.; FRIZZO, L.S.; BERTOZZI, E.; BONAZZA, J.C.; SEQUEIRA, G.; MARTÍ, E.; ROSMINI, M.R.

Santa Fe

Jornada; III Encuentro Bioquímico del Litoral y VI Jornadas de comunicaciones Técnico-Científicas; 2005

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas-Universidad Nacional del Litoral

Los terneros sometidos a sistemas de crianza artificial sufren estrés, entre otras causas, por el desbalance entre las bacterias patógenas y no patógenas que colonizan el intestino. Esto desencadena problemas nutricionales y sanitarios que afectan la productividad. Los métodos basados en biología molecular son utilizados para el análisis de ecosistemas complejos y son útiles para monitorear los probióticos entre las bacterias de la microbiota normal. Los métodos de electroforesis en gel en gradiente de temperatura (TGGE) o en gradiente desnaturalizante (DGGE) son utilizados para analizar comunidades microbianas, basándose en la separación de las secuencias específicas del amplicón de una región del gen 16S rRNA. Una estimación de la diversidad bacteriana es posible si se extrae DNA de la microbiota predominante y, posteriormente, se lo puede amplificar. El objetivo de este trabajo fue adaptar una técnica, diseñada para aislar DNA genómico a partir de barros activados, para ser aplicada a la materia fecal de terneros lactantes y que permita la amplificación del gen 16S rRNA de la comunidad bacteriana predominante. Se obtuvieron muestras de 240 mg de material fecal a partir de 2 terneros lactantes. La mitad del material fue procesado inmediatamente después de su obtención. La otra porción se conservó, durante 7 d, en congelación, para estudiar la aplicabilidad de la técnica en muestras almacenadas. En todas las muestras la extracción del DNA se realizó en 3 etapas consecutivas: 1) sonicación, 2) shock térmico y  3) lisozima + SDS. La integridad del DNA obtenido en cada paso se verificó mediante una corrida electroforética. El diseño permitió comparar la extracción a tiempo 0 y a los 7 d. La amplificación del 16S rRNA se realizó con los primers universales 616v y 609r sobre los moldes de DNA aptos para PCR. A tiempo 0, se obtuvo DNA entero sólo en los pasos 2 y 3. Del paso 1 se obtuvo DNA degradado, por lo cual, para las muestras congeladas, se redujo el tiempo de sonicación de 1 h a 15 min. A pesar de esta modificación, la sonicación generó DNA degradado. Sólo se empleó como molde el DNA obtenido en los pasos 2 y 3. La congelación no modificó las muestras. El producto de la PCR mostró un tamaño aproximado de 800 pb. La sonicación no resultó adecuada para obtener el DNA molde. La técnica de extracción del DNA para la amplificación del gen 16S rRNA, que se utilizará en la materia fecal de terneros lactantes, incluirá una etapa de shock térmico y otra de lisozima + SDS.