Efecto de los componentes del medio de cultivo en la producción de sustancias tipo bacteriocinas

ASTESANA, D.M.; BLAJMAN J.E.; FUSARI, M.L.; BERISVIL, A.P.; FRIZZO, L.S.; SOTO, L.P.; ZBRUN, M.V.; SEQUEIRA, G.J.; SIGNORINI, M.L.; ROSMINI, M.R.

Casilda

Jornada; XV Jornadas de Divulgación Técnico Científicas 2014; 2014

Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional de Rosario

Las bacteriocinas son proteínas o péptidos producidos por algunas bacterias que por lo general producen inhibición sobre bacterias que están estrechamente relacionadas con la cepa productora1. Los componentes del medio de cultivo pueden influir modificando la producción de bacterocinas por parte de las bacterias ácido lácticas (BAL). El propósito de éste trabajo fue evaluar la producción de sustancias inhibitorias tipo bacteriocinas utilizando diferentes medios de cultivo, en donde variaba la composición de sus componentes principales. Para llevar a cabo el trabajo se utilizaron los medios, TGE (Caldo Triptona Glucosa) modificado, CGB (Caldo Caseína Glucosa) y MRS (de Man, Rogosa y Sharpe) con diferentes modificaciones. La composición del TGE modificado fue Proteosa Peptona 1 %, Glucosa 1%, Extracto de levadura 1%, Sulfato de magnesio 0,005%, Sulfato de manganeso 0,005%, Agar 1,5%, Tween 80 0,1%, pH 6,8. La composición de CGB fue Proteosa Peptona 2 %, Glucosa 1%, Extracto de levadura 0,5%, Citrato de amonio 0,2%, Fosfato di sódico 0,2%, Sulfato de magnesio 0,01%, Sulfato de manganeso 0,005%, Agar 1,5%, Tween 80 0,1%, pH 6,8. La composición del MRS fue Peptona 1%, Glucosa 2%, Extracto de levadura 0,4%, Extracto de carne 0,8%, Acetato de sodio 0,5%, Citrato de amonio 0,2%, Fosfato dipotásico 0,2%, Sulfato de magnesio 0,02%, Sulfato de manganeso 0,005%, Tween 80 0,1%, pH 6.5. Además se modificó la fuente de carbono del MRS reemplazándose por maltosa (MRS1) y sacarosa (MRS2). También se utilizó MRS sin tween 80 (MRS3). Las cepas que se utilizaron forman parte del cepario del Laboratorio de Alimentos del Departamento de Salud Pública, FCV, UNL y fueron aisladas de la microbiota intestinal de terneros jóvenes. Las cepas con actividad antimicrobiana en estudio fueron Pediococcus acidilactici DSPV 66T, P. acidilactici DSPV 69T Lactobacillus plantarum DSPV 106T2. La cepa tapiz utilizada fue Enterococcus faecium DSPV 22T. Las bacterias fueron descongeladas y sembradas en placas de medio MRS y se incubaron a 37°C durante 48 a 72 h. La técnica de difusión en agar se utilizó para determinar la producción de sustancias inhibitorias tipo bacteriocinas. Para esto se tomó una colonia de la placa, se repicó en 4 ml de caldo de los diferentes medios y se incubó a 37°C durante 16 h. Luego se repicó en tubos falcon con 10 ml de caldo de los diferentes medios y se incubó a 37ºC a 16 h. Posteriormente se procedió a centrifugar para extraer el sobrenadante o extracto libre de células (ELC). A continuación se modificó el pH, agregando hidróxido de sodio 3M, llevándolo a un valor entre los 6 y 6,5 para obtener el ELC neutralizado (ELCN). Los ELCN se esterilizaron por filtración y se conservaron en freezer a -20°C hasta su utilización. Posteriormente sobre una placa que contenía 10 ml de medio MRS sólido se adicionaron 8 ml de medio MRS semisólido que previamente se inoculó con 40 μl de un cultivo fresco (overnight) de la cepa indicadora. Se dejó solidificar y se realizaron hoyos de 5mm de diámetro donde se depositaron 25 μl del ELCN. Las placas se llevaron a 5°C durante una hora para permitir que los ELCN puedan difundir a través del agar. Después se incubaron las placas en estufa a 37°C durante 24 h y se observó la presencia o ausencia de zonas de inhibición de crecimiento bacteriano. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Para la cepa P. acidilactici DSPV 66T se observaron halos de 2 mm de diámetro y para la cepa P. acidilactici DSPV 69T se observaron halos de 2,5 mm de diámetro en todos los medios con la excepción de MRS1 y MRS2 donde no aparecieron halos en dos de las tres réplicas. Para la cepa L. plantarum DSPV 106T se observaron halos de 1,5 mm en las tres réplicas de los medios TGE, CGB, MRS1 y MRS2, pero sólo manifestó halo en una de las replica en MRS. La ausencia de tween 80 no modificó la producción de sustancias tipo bacteriocinas. Si bien resulta dificultoso establecer si alguno de los medios mostró mayor producción de sustancias antimicrobianas, en los medios CGB, MRS1 y MRS2 las cepas produjeron las sustancias inhibitorias en forma más constante y predecible y por lo tanto podrían ser de elección en los trabajos futuros sobre producción de las sustancias para su purificación. BIBLIOGRAFÍA: 1- Klaenhammer, T.R. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 70: 337-349. 1988. 2- Astesana, D.M.; Blajman, J.E.; Fusari, M.L.; Frizzo, L.S.; Soto, L.P.; Zbrun, M.V.; Sequeira, G.J.; Signorini, M.L.; Rosmini, M.R. Comparación de técnicas para la detección de bacteriocinas. In XIV jornada de divulgación técnico científica 2013, Universidad Nacional de Rosario, Rosario, 31-32, 2013.