Bacterias ácido lácticas de origen bovino productoras de sustancias antimicrobianas

ASTESANA, D.M.; BLAJMAN, J.E.; ALTINA, M.G.; ROMERO SCHARPEN, A.; SOTO, L.P.; ZBRUN, M.V.; MARTÍ, L.E.; ROSMINI, M.R.; FRIZZO, L.S.

Esperanza

Jornada; XII Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2011; 2011

Universidad Nacional de Rosario-Universidad Nacional del Litoral

Las bacterias ácido lácticas (BAL) poseen efectos benéficos en la prevención y tratamiento de enfermedades intestinales. Uno de los medios por el cual alcanzan este efecto es debido a la producción de sustancias específicas como son las bacteriocinas4. Estas son proteínas o péptidos producidos por algunas bacterias y que poseen actividad antimicrobiana frente a grupos bacterianos estrechamente relacionados. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar la capacidad de las BAL de origen bovino para producir sustancias con actividad antimicrobiana. Se utilizaron BAL autóctonas pertenecientes a la microbiota intestinal de terneros jóvenes, que fueron aisladas a partir de materia fecal extraída por masaje rectal. Las heces fueron transportadas refrigeradas en una conservadora hasta el laboratorio donde se realizaron diferentes diluciones en solución de Ringer 1/4. A partir de éstas se sembraron placas con medio selectivo (agar LAMVAB) que se incubaron durante 48 h a 37°C en anaerobiosis. A partir de las placas se seleccionaron colonias tomando representantes de las diferentes morfologías presentes y se las repicó en tubos y placas con medio MRS a 37°C por 24 h para asegurarnos un correcto aislamiento. A partir de los tubos con crecimiento fueron obtenidos los datos de velocidad de crecimiento, aspecto del cultivo, prueba de catalasa y morfología (bacilos o cocos). Los microorganismos obtenidos fueron conservados a -80°C utilizando glicerol al 30% como crioprotector. Cada microorganismo aislado fue cultivado en caldo MRS durante 18 h y previo tratamiento térmico se centrifugaron para obtener el sobrenadante o Extracto Libre de Células Sin Neutralizar (ELCSN). Posteriormente se modificó el pH llevándolo a un valor entre 6 y 6,5 y se los esterilizó por filtración obteniendo el Extracto Libre de Células Neutralizado (ELCN). Ambos extractos fueron congelados a -20°C hasta su utilización. La actividad antimicrobiana de cada cepa se evaluó por medio del método de difusión en agar. Los microorganismos indicadores fueron inoculados en el agar ensayo y después de ser colocados en la placa de petri se realizaron hoyos donde se colocaron los ELCSN y los ELCN. Las zonas claras detectadas alrededor de los hoyos indicaron la inhibición del crecimiento de los microorganismos indicadores debido a la presencia de sustancias inhibidoras. Los microorganismos que resultaron productores de sustancias antimicrobianas fueron identificados utilizando técnicas moleculares (amplificación del gen 16S rARN, secuenciación y comparación de bases de datos. El ADN fue recupero de acuerdo a la metodología de Marmur3 y modificada por Kurzak2. La integridad del ADN fue visualizada por electroforesis en gel de agarosa al 0,7% p/v. El gen 16S rRNA fue amplificado por PCR utilizando para ello los primers específicos 27F y 1492R1. Cada tubo de reacción (50 µl) contenía 10 µl 5X PCR buffer para Taq polimerasa, 1,5 mM MgCl2 200 µM de cada dNTP, 0,4 µM de cada primer y 2 µl de Taq polimerasa. El programa para el termociclador fue el siguiente: 94°C durante 5 min; 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min y 72°C durante 1 min; finalmente un paso de extensión a 72°C durante 7 min. Posteriormente los productos de PCR fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v el cual fue teñido con GelRed® y visualizado bajo luz UV.  La comparación de las secuencias obtenidas se realizo on-line usando el algoritmo Blast del NCBI (National Center of Biotechnology Information) en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov. De los microorganismos aislados se obtuvieron tres cepas con capacidad antimicrobiana: 2 de ellas pertenecieron a la especie Pediococcus acidilactici y la otra fue un Lactobacillus plantarum. Una de las cepas de Pediococcus acidilactici presentó las mejores características inhibitorias. Esta cepa presentó una colonia verde claro grande en agar LAMVAB. El crecimiento en tubo mostró una biomasa con características de arenilla y sin producción de gas. La prueba de la catalasa fue negativa. El pH que la cepa produjo en el medio de cultivo (caldo MRS) fue de 3,7. El ELCSN mostró actividad antimicrobiana frente a Enterococcus faecium, Salmonella dublin, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens. El ELCN manifestó actividad antimicrobiana únicamente frente a Enterococcus faecium y Pseudomonas fluorescens. En conclusión la cepa mostró su poder inhibitorio y resulta interesante tanto para ser incorporada como tal a un inóculo probiótico como junto a la sustancia antimicrobiana que produce. 1. Kim, M. & Chun, J. Bacterial community structure in Kimchi, a korean fermented vegetable food, as revealed by 16s rRNA gene analysis. Int. J. Food Microbiol. 103:91-96, 2005. 2. Kurzak, P., Ehrmann, M.A. & Vogel, R.. Diversity of lactic acid bacteria associated with ducks. Syst. Appl. Microbiol. 21:588-592, 1998. 3. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 13:208-218, 1961. 4. Vázquez, J. A., González, M. P., y Murado, M. A., Effects of lactic acid bacteria cultures on pathogenic microbiota from fish, Aquaculture 245:149-161, 2005.