Aislamiento y caracterización de fagos de Escherichia coli enterohemorrágica para fagoterapia

DINI, CECILIA; DE URRAZA, PATRICIO J.

Buenos Aires

Congreso; Tercer Congreso Argentino de Microbiología de Alimentos (CAMA III); 2006

Asociación Argentina de Microbiología (AAM)

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE FAGOS DE Escherichia coli ENTEROHEMORRÁGICA PARA FAGOTERAPIA Dini, C.1,2 y de Urraza, P. J.1,2 . 1Cátedra de Microbiología General - Dpto. de Cs. Biológicas - Fac. de Cs. Ex. - U.N.L.P - 47 y 115 (1900) - La Plata - Argentina, (0221) 425-0497 ; 2CIDCA- Dpto. de Qca.- Fac. de Cs. Ex.- U.N.L.P. E-mail: ceciliadini@yahoo.com.ar Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) es el principal agente causal del Síndrome Urémico Hemolítico en niños menores de 5 años y genera una alta tasa de mortalidad. Los alimentos constituyen la principal vía de contagio y, dado que el mayor reservorio de EHEC son los bovinos, la infección se asocia al consumo de carne vacuna sin suficiente cocción. Una metodología para disminuir la carga de EHEC del intestino vacuno es la fagoterapia, que consiste en la incorporación de fagos específicos de estas bacterias a la alimentación de los terneros. El o los fagos a utilizar deben ser líticos, altamente infectivos, no codificar para genes de virulencia bacteriana o resistencia a antibióticos, y ser estables. Con este fin se aislaron y purificaron bacteriófagos de EHEC de carne picada y de materia fecal vacuna, y se ensayó el rango de huésped para cada uno de ellos. Para la obtención de fagos se tomaron muestras de 10 grs de carne y de materia fecal, se homogeneizaron en Stomacher con 90 ml de buffer SM y Caldo Escherichia coli modificado con 0,02 g/lt de novobiocina (mEC+n) respectivamente. A los homogenatos de carne en buffer SM, se les agregó 10 ml de Caldo mEC+n 10x. Se emplearon como cepas indicadoras una mezcla de EHEC O157 (aislados hospitalarios y cepas de colección), y otra mezcla de EHEC no O157 aisladas de alimentos, y se agregó CaCl2 (10 mM final). Las distintas combinaciones homogenato/cepas indicadoras se incubaron durante 24 hs a 37 ºC. Pasado este tiempo se les adicionó CHCl3 hasta una concentración final de 40% v/v y se dejaron reposar a Tamb durante 30’. Para determinar la presencia de fagos, se realizó un spot test sobre cada una de las cepas utilizadas en los enriquecimientos, y, de aquellos donde se observaron placas de lisis, se propagó cada aislado en Caldo Casoy adicionado con CaCl2 10 mM. Posteriormente los aislados se purificaron partiendo de una placa de lisis obtenida en un recuento por el método de la doble capa, y se propagaron en Caldo Casoy hasta alcanzar títulos de entre 108 y 109 UFP/ml. Finalmente, las muestras se filtraron con membrana de 0,45 m y se ensayó el rango de huésped de c/u de los 15 fagos obtenidos mediante la técnica de “streak” con todas las cepas empleadas en los enriquecimientos y la cepa indicadora WG5 de E. coli (ISO 10705-2:1999). Asimismo, se ensayaron como huéspedes aislados hospitalarios de Shigella flexneri, Shigella sonnei y E. coli enteroinvasiva (EIEC). Como resultado de estos ensayos se obtuvieron 12 fagos de EHEC que no infectaron a la E. coli WG5 (cepa no patógena) y 3 de ellos inhibieron también el desarrollo de S. flexneri (otro patógeno alimentario). No se obtuvieron aislados que infecten EIEC. Se concluye que los 9 fagos que resultaron ser específicos de EHEC son candidatos promisorios para su uso en fagoterapia.