Analisis comparado de la diversidad genetica y la sensibilidad killer de Brettanomyces bruxellensis y Pichia guilliermondii de uvas y vinos de la Patagonia

SÁEZ J.S.; LOPES C.A.; CONSTANZO M; CABALLERO A.C.; SANGORRÍN M.P.

Enologia

AMP & Asociados

Año: 2008 vol. V p. 1 - 14

1668-3889

Las levaduras del género Brettanomyces son conocidas por producir fenoles volátilescausantes de graves defectos aromáticos en el vino. Recientemente, se ha demostrado que laespecie Pichia guilliermondii también es capaz de producir estos compuestos. P. guilliermondiies una levadura habitual de uvas, mostos de fermentación y superficies de bodegaspatagónicas, sin embargo ningún aislamiento de Brettanomyces bruxellensis había sidodetectado hasta el momento en estos sustratos. En este trabajo se realizó un análisiscomparado de la diversidad existente entre aislamientos de las dos especies contaminantesde vinos productoras de etilfenoles B. bruxellensis y P. guilliermondii indígenas de la regiónPatagónica, conservados en la colección de cultivos del laboratorio. Finalmente se evaluó lasensibilidad de ambas especies a toxinas killer producidas por levaduras de referencia eindígenas, con el fin de desarrollar una estrategia de biocontrol que permita combatir eficazy conjuntamente a estas levaduras contaminantes.La confirmación de la identidad de las levaduras se realizó por el método ITS1-5.8S-ITS2PCR-RFLP y secuenciación de la región D1/D2 del 26S-ADNr y la diversidadintraespecífica se evaluó mediante las técnicas moleculares de RAPD-PCR y mtDNA-RFLPcon la enzima HinfI. La sensibilidad a toxinas killer de las levaduras contaminantes se evaluófrente a 20 levaduras indígenas y 3 de colección pertenecientes a las especies Metschnikowiapulcherrima, Pichia anomala y Torulaspora delbrueckii por la técnica de inhibición decrecimiento en placa. La diversidad intraespecífica de la especie B. bruxellensis fue mayor quela detectada para P. guilliermondii, a pesar que los primeros provinieron todos de una mismabodega y los últimos de diferentes bodegas y vendimias. En el análisis de mtDNA-RFLP,evidenció la presencia de ocho patrones diferentes entre los aislamientos de B. bruxellensis,mientras que los aislamientos de P. guilliermondii presentaron todos igual perfil de bandas.En el análisis de RAPD-PCR, los cebadores que permitieron una mejor diferenciación delos aislamientos fueron OPA 3 para la especie B. bruxellensis y OPA 10 para la especie P.guilliermondii, detectándose en ambos casos 6 perfiles diferentes. El empleo combinado deambos métodos (RAPD-PCR y mtDNA-RFLP) resultó en una herramienta poderosa paraevidenciar la diversidad intraespecífica de las dos especies analizadas.Se observó una sensibilidad diferencial de las dos levaduras contaminantes a losaislamientos killer indígenas de las tres especies ensayadas. Los aislamientos de B. bruxellensisfueron sensibles a las toxinas producidas por M. pulcherrima y P. anomala, mientras que losde P. guilliermondii sólo se vieron afectados por P. anomala. Sólo una cepa de T. delbruekiievitó en alto porcentaje el desarrollo de B. bruxellensis. Algunos de estos aislamientosindígenas se vislumbran como una interesante herramienta para el biocontrol de estaslevaduras contaminantes de bodegas.