Desarrollo y validación de una metodología basada en disolventes supramoleculares para la extracción de ácido shikímico a partir de una matriz vegetal

YONNY, M. E.; ESCAÑUELA, P.; BALLESTEROS-GÓMEZ, ANA; RUBIO, S.; NAZARENO M. A.

Corrientes

Congreso; XI Congreso Argentino de Química Analítica; 2021

AAQA

Las plantas como organismos sésiles se encuentran expuestas durante su desarrollo a condiciones desfavorables que provocan estrés abiótico tales como escasez hídrica, temperaturas extremas, entre otras, que, desde el punto de vista productivo, conducen a enormes pérdidas de cosechas.1 Las plantas han desarrollado complejos mecanismos de aclimatación y adaptación que les confieren grados variables de tolerancia al estrés. Por ello, después del reconocimiento de la situación de estrés, para responder de una manera rápida y eficiente, las plantas activan mecanismos que comprenden respuestas tanto morfológicas-mecánicas como bioquímicas.2 Entre las últimas se destaca el incremento en la síntesis de metabolitos primarios y secundarios que emergen principalmente de la vía de síntesis del ácido shikímico (AS), por lo que este compuesto es un intermediario importante en el metaboloma de las plantas.3 La determinación de los niveles de dicha molécula clave podría ser útil en la investigación de los efectos del estrés abiótico en las plantas para obtener así una mejor comprensión de las vías metabólicas involucradas en su respuesta. Debido a que el AS es un intermediario de reacción, sus niveles en los tejidos vegetales son normalmente bajos, requiriendo procedimientos analíticos cada vez más sensibles para su extracción y cuantificación. En este sentido, los disolventes supramoleculares ofrecen la posibilidad de desarrollar extracciones eficientes que permitan alcanzar una adecuada pre-concentración del analito. Estos son líquidos nanoestructurados, producidos a partir de disoluciones hidro-orgánicas de moléculas anfifílicas mediante procesos espontáneos de autoensamblaje y coacervación. Las diferentes regiones de polaridad de su estructura tridimensional y el elevado número de centros enlazantes proporcionan excelentes propiedades de solvatación para los compuestos de interés y altos rendimientos de extracción.4 El objetivo de este trabajo fue desarrollar y validar una metodología novedosa basada en disolventes supramoleculares para la extracción de AS a partir de hojas de plantas estresadas. Se realizaron ensayos para optimizar los parámetros de la micro-extracción: determinación de la composición de la disolución de síntesis del disolvente (octanol, tetrahidrofurano y agua), y efectos del pH y de la fuerza iónica. Se evaluaron diferentes cantidades de muestra vegetal buscando minimizarla sin perder representatividad. La separación, detección y cuantificación de dichos metabolitos presentes en el extracto obtenido, se realizó por HPLC-DAD. Se trabajó con una columna C18 y elución isocrática con fase móvil acetonitrilo:agua:ácido fosfórico 95:4:1 v/v. El AS eluye a 6,0 min en 15 min de tiempo total de análisis cromatográfico. El pre-tratamiento de muestra optimizado fue validado determinando las cifras de mérito correspondientes. La respuesta del detector fue lineal en el intervalo 0,02-1,4 μmol/mL (R2=0,9970). Los valores de LOD y LOQ se establecieron en: 0,0008 y 0,002 μmol/mL, respectivamente. Se evaluó también el efecto de la matriz de muestra, encontrándose un efecto de un 30% de supresión de señal por lo que para su compensación la curva de calibración fue realizada sobre la muestra en estudio. Los porcentajes RSD como medida de la precisión intra- e inter-día fueron, 3,7 y 7,5%, respectivamente; y la recuperación, como parámetro de exactitud, fue de entre 80-100% con tres niveles de adición. Finalmente, se determinó la concentración de AS en hojas secas de plantas de melón y pimiento cultivadas bajo condiciones de estrés térmico. El rango de concentración de AS en las muestras analizadas fue de 0,16 ± 0,01 a 31 ± 2 mg/g, siendo significativamente superiores en plantas estresadas respecto de los controles para las dos especies en estudio. La metodología de extracción desarrollada y validada resultó ser simple, rápida, sensible, selectiva, reproducible y aplicable para la determinación de AS y sus variaciones en las muestras en estudio.