Optimización de la determinación mediante RP-HPLC de tiamina en harinas de trigo

NICOLÁS MICHLIG; MARCELINO FREYRE; FRANCO VAN DE VELDE; CELILA MARÍA DEL HUERTO BERNARDI

Santa Fe, Prov. de Santa Fe

Congreso; 6° Congreso Argentino de Química Analítica; 2011

Asociación Argentina de Químicos Analíticos - CONICET - AGENCIA - Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional del Litoral

Se llevó a cabo la optimización de la determinación de tiamina (vitamina B1) en harinas de trigo mediante cromatografía líquida  de alta eficacia en fase reversa (RP-HPLC) [1,2]. Se utilizó una columna Hypersil C18 de 10cm, 4.6mm de diámetro, 5μ de tamaño de partícula en  modo isocrático. Para optimizar las condiciones cromatográficas se empleó clorhidrato de tiamina como patrón realizando la derivatización pre-columna a tiocromo, compuesto fluorescente, y llevando a cabo la extracción del mismo con isobutanol para su posterior inyección. Se utilizó un diseño experimental de Box Behnken donde los factores a estudiar fueron: caudal (0,5-1ml), pH (5,8-7,5; buffer fosfato 20mM) y fase orgánica la que se varió en un entorno de 20%-90% en la fase móvil (dicha fase orgánica constaba de 90% metanol y 10% acetonitrilo). Se evaluaron las respuestas área, ancho de pico y tiempo de retención y se calculó la función deseabilidad de Derringer (D) otorgándole distintos pesos a cada una de las respuestas [3]. Las condiciones óptimas donde se encontró adecuada deseabilidad (D=0,83), fueron: 1 ml/min de caudal, pH :5,8 y fase orgánica igual a 90%. Posteriormente, el tiocromo se aisló mediante dos tratamientos: extracción en fase sólida (SPE) utilizando cartuchos poliméricos comerciales (poliestireno-divinilbenceno) e isobutanol con posterior análisis del mismo por HPLC en las condiciones elegidas. Utilizando el patrón mencionado se construyeron dos curvas de calibrado validando en términos de límite de detección (LD), límite de cuantificación (LC) y rango lineal (RL). Para la extracción mediante SPE se obtuvo  3,97ng/ml (LD), 12,03 ng/ml (LC)  y 12,03-75 ng/ml para RL.  En el caso de la extracción con isobutanol se encontró  3,75ng/ml (LD), 11,36 ng/ml (LC)  y 11,36-102,50 ng/ml para RL[4]. Luego se analizaron las muestras de harina de trigo mediante el método de adición estándar. La tiamina presente en las muestras se extrajo mediante tratamiento ácido y enzimático con posterior conversión de la misma a tiocromo y  se llevó a cabo la separación del mismo mediante los  dos tratamientos mencionados. Los resultados provenientes de ambas extracciones presentaron una recuperación de 79-101% para SPE y 63-74% para isobutanol en las muestras analizadas[5]. En este trabajo se logró, además, una adecuada resolución empleando una columna corta que reduce el tiempo de retención y el volumen de fase móvil empleado para el análisis.