Efecto de la modificaci¨®n de b-ciclodextrina y la conservaci¨®n de enzimas en sistemas liofilizados

SANTAGAPITA, PATRICIO R.; G¨®MEZ BRIZUELA, L.; MAZZOBRE, MAR¨ªA F.; VILLALONGA SANTANA, R.; CORTI, H.R.; BUERA, MAR¨ªA DEL P.

Tandil, Argentina

Congreso; XV CONGRESO ARGENTINO DE FISICOQUÍMICA Y QUÍMICA INORGÁNICA; 2007

Asociaci¨®n Argentina de Investigaci¨®n F¨ªsicoqu¨ªmica

En la formulaci¨®n de matrices para la conservaci¨®n de biomol¨¦culas frecuentemente seemplean combinaciones de sac¨¢ridos, debido a que las interacciones a trav¨¦s de puenteshidr¨®geno tienen un efecto estabilizante sobre las mismas. El efecto protector de los sac¨¢ridosdepende por lo tanto de su capacidad para generar dichas interacciones: mientras que ensistemas liofilizados la trehalosa protege a las enzimas, las ¦Â-ciclodextrinas (¦Â-CD) ofrecenescasa protecci¨®n, a pesar de que ambos est¨¢n constituidos por unidades de glucosa. Elobjetivo de este trabajo fue analizar el efecto de las modificaciones de la ¦Â-CD a trav¨¦s de supolimerizaci¨®n (poli-¦Â-CD) y/o posterior carboximetilaci¨®n (CM-poli-¦Â-CD) [1], sobre laestabilidad enzim¨¢tica, en sistemas liofilizados. Se liofilizaron soluciones de 10% de trehalosa(T) o pol¨ªmero (¦Â-CD, poli-¦Â-CD, CM-poli-¦Â-CD -con 40% de grado de carboximetilaci¨®n-) y suscombinaciones con trehalosa, conteniendo la enzima ¦Â-fructofuranosidasa (invertasa) de S.cerevisiae. Luego de la liofilizaci¨®n, los sistemas se equilibraron a actividades de agua (aw) de0,22 y 0,43 a 25¡ãC. Posteriormente se realiz¨® un tratamiento t¨¦rmico a 87¡ãC y se analizaron laactividad enzim¨¢tica, las transiciones t¨¦rmicas de los sistemas (Tg y fusiones) y se obtuvieronim¨¢genes de las matrices por microscop¨ªa de fuerza at¨®mica. Durante la liofilizaci¨®n latrehalosa confiri¨® la mayor protecci¨®n a la invertasa (se recuper¨® casi 100% de actividad);mientras que en poli-¦Â-CD se recuperaron niveles superiores al 85 % de la actividadenzim¨¢tica, en ¦Â-CD y CM-poli-¦Â-CD estos fueron menores que 50 y 20%, respectivamente.Los aditivos m¨¢s efectivos en conferir protecci¨®n durante el tratamiento t¨¦rmico fueron poli-¦Â-CD (con y sin T) y ¦Â-CD+T. ¦Â-CD no fue un aditivo efectivo para proteger la enzima por su altainsolubilidad. Mediante su polimerizaci¨®n se logr¨® mejorar sus caracter¨ªsticas hidrof¨ªlicas,aumentando su solubilidad y su capacidad de interactuar con la enzima. Al carboximetilarlo, encambio, se redujo su capacidad de generar puentes H y no se comport¨® como agente protector.El agregado de trehalosa a la matriz ¦Â-CD tuvo un efecto sin¨¦rgico: la ¦Â-CD retras¨®/inhibi¨® lacristalizaci¨®n de trehalosa y ¨¦sta mejor¨® la solubilidad de ¦Â-CD, previniendo as¨ª ladesnaturalizaci¨®n proteica protegiendo regiones hidrof¨®bicas de la prote¨ªna.