Caracterización de una proteasa proveniente de cardo negro (Cirsium vulgare) en su forma zimogénica

LUFRANO, D.; FARO, R.; VAIRO CAVALLI, S.; SIMÕES, I.; CASTANHEIRA, P; FARO, C.

Barcelona

Congreso; XXXIV Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular; 2011

Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM)

Las proteasas del tipo pepsina (familia A1) de plantas son endopeptidasas activas a pH ácido, sintetizadas como preproproteasas y usualmente secretadas en forma inactiva. El propétido se ha asociado con direccionamiento vacuolar, modulación de la actividad del precursor y plegamiento proteico. Las características del propéptido y de la primera porción del dominio N-terminal han cobrado interés en el estudio del mecanismo de activación de los diferentes tipos de proenzimas. El objetivo del trabajo consiste en caracterizar el zimógeno de cirsina, aspartilproteasa de flores del cardo Cirsium vulgare (Savi) Ten. (Asteraceae) y relacionar el rol del propéptido con la inactivación del precursor como ha sido sugerido para profitepsina de cebada. Se aisló RNA total de flores inmaduras con un kit comercial. Luego de la retrotranscripción, se amplificó la secuencia del zimógeno mediante primers diseñados a partir de regiones altamente conservadas de los extremos del marco de lectura abierta de las proteasas aspárticas de Astereaceae. El amplicón se clonó en un vector pGEMTeasy y subclonó sin la región pre entre los sitios XhoI y NheI del vector de expresión pET-23d utilizando primers específicos para C. vulgare. El precursor de cirsina fue expresado en E. coli BL21 Star y recuperado de la fracción insoluble como cuerpos de inclusión. Se purificó por exclusión molecular seguido de intercambio aniónico. Se determinó la actividad proteolítica de la proteína purificada frente al sustrato fluorogénico (MCA)KKPAEFFALK(DNP). Los resultados obtenidos muestran que el precursor de cirsina es activo sugiriendo que el mecanismo de inactivación del mismo difiere del de fitepsina a pesar de la presencia de los residuos Lys11 y Tyr 13 que han sido asociados a esa función.