Las vesículas extracelulares producidas por Bacillus subtilis liberan ARN y atraviesan de manera intacta células intestinales humanas Caco-2

ANA PAULA DOMINGUEZ RUBIO; JIMENA H MARTÍNEZ; CHRISTIAN MIQUEL SÁNCHEZ LÓPEZ ; ANTONIO MARCILLA ; MARIANA PIURI; OSCAR E PÉREZ

CABA

Jornada; II Jornadas de Jóvenes Bionanocientíficxs (JoBioN).; 2021

IQUIBICEN-CONICET, CIBION-CONICET, INS-UNSAM e Instituto Leloir

Las Vesículas Extracelulares (VEs) bacterianas forman parte de la comunicación entre las bacterias de la microbiota y el ser humano. Las VEs están formadas por una bicapa lipídica de membrana y contienen componentes citoplasmáticos como ADN, ARN y proteínas.Nuestro objetivo fue investigar si las VEs de B. subtilis, 115±27 nm, pueden atravesar de manera intacta células Caco-2 diferenciadas en monocapa utilizadas como un modelo in vitro de barrera intestinal. A su vez, estudiamos la localización celular en células Caco-2 de los ARNs contenidos en las VEs bacterianas. Mediante Microscopía Confocal, comprobamos que la internalización de las VEs de B. subtilis marcadas con CFSE por las células Caco-2 es tiempo dependiente. Con el objetivo de estudiar el proceso de transcitosis, las células Caco-2 fueron sembradas y diferenciadas en un sistema transwell. Las VEs marcadas con CFSE fueron sembradas en la cámara superior y luego a diferentes tiempos de incubación (0, 5, 15, 30, 45, 60, 120 y 240 min) las EVs fueron cuantificadas en la cámara inferior por mediciones de Fluorescencia y Nanoparticle Tracking Analysis. También, fueron observadas por Microscopía de Fluorescencia. VEs intactas fueron transportadas a través de la monocapa las células intestinales polarizadas a los 120 min y aumentaron a los 240 min en un 30%. Este proceso, a su vez, resultó ser dosis-dependiente. Realizando una doble marcación de las VEs, con SYTO RNA green (ARN) y BODIPY TR Ceramide red (membrana plasmática), e incubándolas con células Caco-2 sin diferenciar, observamos por Microscopía Confocal que el ARN de las VEs localizaban con el ADN del núcleo celular eucariota marcados con DAPI. En cambio, la bicapa lipídica de las VEs permaneció en el citoplasma de las células. En este trabajo demostramos que las VEs bacterianas pueden ser transportadas a través de células del epitelio gastrointestinal y especulamos que este mecanismo podría ser el primer paso que permita que las VEs llegar al torrente sanguíneo del hospedador y así, poder llegar a los tejidos y órganos de todo el cuerpo donde se han demostrado efectos de los probióticos en el hospedador. A su vez, Los ARN bacterianos podrían acceder al núcleo celular eucariota y esto podría tener algún efecto en la modulación de la expresión de genes. A futuro, la expresión y posterior encapsulación de moléculas bioactivas como ADN, ARN, y/o proteínas en VEs producidas por bacterias probióticas podría tener implicaciones en terapias clínicas y en la industria de los alimentos y nutracéutica.