AISLAMIENTO DE UNA NUEVA POBLACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DE LACTICASEIBACILLUS CASEI BL23 MEDIANTE COLUMNA DE FILTRACIÓN HIDROSTÁTICA

CECILIA D´ANTONI; ANA PAULA DOMINGUEZ RUBIO; MARCELA MORETTON; DIEGO CHIAPPETTA; OSCAR E PÉREZ

CABA

Congreso; Fronteras en Nanobiotecnología III; 2022

Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires

Las vesículas extracelulares (VEs) son nanovesículas formadas por una bicapa lipídica que contiene moléculas bioactivas. Las VEs liberadas por bacterias probióticas median, al menos parcialmente, los efectos benéficos de las bacterias en el huésped. El método convencional para aislar VEs es la ultracentrifugación (UC). Sin embargo, este método presenta múltiples desventajas, como la lisis de VEs por estrés mecánico y la alta contaminación con proteínas. Además, algunas subpoblaciones de VEs permanecen en el sobrenadante, impidiéndose su separación. El objetivo de este trabajo es comparar el método alternativo de filtración hidrostática (FH) para el aislamiento de VEs producidas por Lacticaseibacillus casei BL23 con el método tradicional de UC1. Con este fin, se estimó la cantidad de VEs mediante cuantificación de proteínas y se obtuvo la distribución del tamaño de partícula mediante dispersión dinámica de luz (DLS).Un cultivo de L. casei BL23 se centrifugó a 4500 g para remover las células y el sobrenadante se filtró mediante membranas con tamaño de poro 0.8, 0.6 y 0.45 μm, respectivamente. Para el método de FH, el filtrado obtenido se colocó dentro de una membrana de diálisis de éster de celulosa (MWCO=1000 kDa) cerrada en su extremo inferior e insertada verticalmente dentro de una columna. La presión hidrostática del líquido dentro de la membrana, empuja al solvente y analitos, como las proteínas, hacia fuera de la membrana. El segundo día, la membrana se rellenó con PBS. El tercer día, se realizó una diálisis en PBS por 3 hs a 4°C. Las muestras dializadas se concentraron utilizando centricones (MWCO=100 kDa). Se comparó el patrón de bandas en SDS-PAGE teñido con Coomassie Blue obtenido por el método de FH con aquel obtenido por el método de UC, previamente puesto a punto en el laboratorio, y se cuantificaron proteínas como medida indirecta de la cantidad de VEs. A continuación, se midió la distribución de tamaños de VEs mediante la técnica de dispersión dinámica de luz (DLS).La muestra obtenida mediante FH resultó contener una cantidad de proteínas que superó más de 60 veces la cantidad de proteínas presentes en la muestra obtenida mediante UC. Al mismo tiempo, el patrón de bandas presente en el gel de poliacrilamida resultó similar para ambas muestras. La distribución de tamaños de VEs en las muestras obtenidas mediante FH mostró dos picos (15,9 nm y 91,1 nm) a diferencia de la muestra obtenida mediante UC, en la cual se observó solo un pico (62,3 nm).La FH resultó un método más eficiente que la UC para el enriquecimiento de VEs producidas por L. casei BL23 en cuanto a la estimación de cantidad de VEs mediante cantidad de proteínas. En cuanto a los datos obtenidos mediante DLS, los resultados indican la presencia de dos subpoblaciones de VEs de diferente tamaño en las muestras obtenidas mediante FH, mientras sólo una subpoblación de VEs se recupera en el pellet de la UC. La presencia de diferentes subpoblaciones deberá ser confirmada mediante técnicas de microscopía electrónica y microscopía de fuerza atómica.1 Domínguez Rubio AP, Martínez JH, Martínez Casillas DC, Coluccio Leskow F, Piuri M, Pérez OE. Lactobacillus casei BL23 Produces Microvesicles Carrying Proteins That Have Been Associated with Its Probiotic Effect. Front Microbiol. 2017 Sep 20;8:1783. doi: 10.3389/fmicb.2017.01783. PMID: 28979244; PMCID: PMC5611436.