AISLAMIENTO DE VESÍCULAS EXTRACELULARES LIBERADAS POR PROBIÓTICOS MEDIANTE FILTRACIÓN HIDROSTÁTICA

CECILIA D´ANTONI; ANA PAULA DOMINGUEZ RUBIO; MARIANA PIURI; OSCAR E PÉREZ

CABA

Jornada; XI Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2022

Facultad de Veterinarias. UBA

Los probióticos han sido utilizados para la prevención de enfermedades en humanos y animales. Las vesículas extracelulares (VEs), liberadas constantemente por todas las células, incluso por probióticos, están formadas por una bicapa lipídica que contiene ADN, ARN y proteínas, y son de tamaño nanométrico. El método más comúnmente usado para aislar VEs es la ultracentrifugación (UC). Sin embargo, la UC presenta múltiples desventajas, como la necesidad de un equipo costoso, la recuperación incompleta de VEs, el estrés mecánico debido a altas velocidades de centrifugación, y la alta contaminación con proteínas. El objetivo de este trabajo es optimizar el protocolo de aislamiento de VEs liberadas por Lacticaseibacillus casei BL23. Se utilizará el método de filtración hidrostática (FH). La FH ha sido previamente efectiva en el aislamiento de VEs urinarias y bacterianas. L. casei BL23 se cultivó en el medio Man-Rogosa-Sharpe (MRS, Biokar Diagnostics) a 37°C por 48 hs (400 ml). Luego, el cultivo se centrifugó a 4500 g por 20 minutos a 4°C para remover las células. El sobrenadante se filtró sucesivamente mediante membranas con tamaño de poro decreciente: 0.8, 0.6 y 0.45 μm (GE Osmonics membranes, Lenntech) para remover el exopolisacárido y debris celular. El filtrado obtenido se colocó dentro de una membrana de diálisis de éster de celulosa (Spectra/Por® Biotech, MWCO=1000 kDa) cerrada en su extremo inferior e insertada verticalmente dentro de una columna, y se incubó overnight (ON) a 4°C. La presión hidrostática del líquido dentro de la membrana, empuja al solvente (agua) y analitos como las proteínas hacia fuera de la membrana (pasaje determinado por el cut-off de la misma). El segundo día, la membrana se rellenó con 200 ml de PBS y se incubó ON a 4oC. El tercer día, se vació la columna y se rellenó con PBS para realizar una diálisis por 3 hs a 4°C. Las muestras dializadas se concentraron utilizando centricones con filtro con MWCO=100 kDa (Sartorius) hasta un volumen final de 6 ml. Se comparó el patrón de bandas en SDS-PAGE teñido con Coomasie Blue obtenido por el método de FH con aquel obtenido por el método de UC, previamente puesto a punto en el laboratorio. Para esto, se cuantificaron proteínas como medida indirecta de la cantidad de VEs. La muestra obtenida mediante FH resultó contener una cantidad de proteínas que superó más de 60 veces la cantidad de proteínas presentes en muestra obtenida mediante UC. Al mismo tiempo, el patrón de bandas presente en el gel de poliacrilamida resultó similar para ambas muestras. La FH resultó un método más eficiente que la UC para el enriquecimiento de VEs producidas por L. casei BL23 en cuanto a la estimación de cantidad de VEs mediante cantidad de proteínas. Este resultado deberá ser confirmado mediante otras técnicas de cuantificación de VEs. Además, el método de FH es un método simple, más económico y evita la exposición de las VEs a estrés mecánico severo.