Avances en la validación de un test rápido y portátil de Coronavirus (SARS-CoV-2) en base a tecnología CRISPR

En el marco de la Unidad Coronavirus COVID-19 impulsada por el MINCyT, el CONICET y la Agencia I+D+i, esta semana se lograron avances en la validación de un método rápido y portátil de diagnóstico molecular del Sars-CoV-2 que usa tecnología CRISPR, al ser probado con éxito en extraídos de muestras de pacientes que fueron aportadas por la Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, dependiente del Ministerio de Salud de la Nación.

Estos avances parten desde el kit diagnóstico portátil desarrollado por la startup CASPR Biotech (empresa de base biotecnológica bajo normativa CONICET impulsada por GridX, una incubadora nacional de empresas de Biotecnología) que permite detectar el material genético del virus a través de una tira reactiva (similar a las que se usan en los test de embarazo) y que fue dado a conocer públicamente en febrero de este año.

“En aquel momento, nosotros habíamos puesto a punto la utilidad de la tecnología CRISPR para detectar el COVID-19 en muestras de saliva inoculadas con fragmentos cortos sintéticos del virus (SARS-CoV-2) que sintetizamos en el laboratorio una vez que fue dado a conocer su código genético. Hoy pudimos probar que el test de detección también funciona en muestras de pacientes infectados y estos resultados pueden detectarse con claridad en tiras reactivas de papel. Estos nuevos resultados representan un paso contundente en el camino de validar la tecnología CRISPR como método de diagnóstico”, indica Federico Pereyra-Bonnet, investigador del CONICET en la Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producción Animal (INPA, CONICET-UBA) e integrante de CASPR Biotech.

Las veinte muestras de material genético –diez correspondientes a pacientes infectados con coronavirus y diez de pacientes que no tenían el COVID-19- analizadas para poner a prueba el método de testeo por CRISPR, ya habían sido previamente procesadas mediante RT-PCR, la metodología de retrotranscripción seguida por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), que es la técnica de diagnóstico molecular validada que usan el Instituto ANLIS/ Malbran y los centros descentralizados.

La metodológica RT-PCR, al igual que la tecnología CRISPR, apunta a reconocer en las muestras la huella digital del virus (su código genético expresado en una secuencia de ARN), pero implica procesos más largos que requieren a su vez de una infraestructura de mayor complejidad así como del uso de reactivos importados y más costosos.

Diferentes métodos de testeo: directos e indirectos

“Es importante poder distinguir entre los diferentes métodos de testeo que existen para la detección del Covid-19 o de cualquier otro virus respiratorio, y tener en cuenta, al margen de la velocidad con la que puedan ofrecer resultados confiables, las distintas tecnologías en las que se basan y a lo que apunta cada una de ellas. Por un lado, están los métodos directos de detección viral que pueden buscar reconocer un antígeno viral o -en el caso de las técnicas moleculares como PCR o CRISPR- una determinada secuencia genética indicativa de la presencia del virus. Por otro lado, están los métodos indirectos, como los basados en análisis serológicos, que permiten identificar la presencia de los anticuerpos que forman parte de la respuesta inmune a un determinado virus. Todos las metodologías sirven y pueden ser las más adecuadas para diferentes fines o situaciones”, indica la especialista en virus respiratorios Débora Marcone, investigadora del CONICET en el Departamento de Microbiología, Inmunología, Biotecnología y Genética de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires (FFyB, UBA), quien se unió al proyecto a partir de la conformación de la Unidad Coronavirus Covid-19.

“En este sentido, la tecnología CRISPR (al igual que lo que ocurre con PCR) podría servir para diagnosticar la infección desde que el paciente comienza con las manifestaciones clínicas o incluso antes, porque lo que permite es detectar el genoma del virus -o sea la presencia del patógeno en el organismo- y no la reacción inmunológica que desencadena”, señala la investigadora.

CRISPR como método de diagnóstico

La tecnología CRISPR es un desarrollo relativamente reciente que en los últimos años revolucionó el campo la biotecnología, conocida por la precisión con la que permite introducir modificaciones genéticas, lo que se conoce como edición génica, a través de cortes específicos en las secuencias de ADN. Por este motivo se habla metafóricamente de CRISPR como una ‘tijera molecular’. Menos conocida es hasta ahora la posibilidad que ofrece esta técnica para diagnosticar infecciones virales a través de la identificación de secuencias genéticas.

“Nosotros llamamos a CRISPR el Google de la naturaleza. A modo de ejemplo, se dice que CRISPR puede encontrar una palabra de veinte letras en una biblioteca con un millón de libros que tengan un millón de palabras cada uno adentro. Digamos que es extremadamente eficiente buscando y encontrando secuencias. CRISPR es en la naturaleza un sistema de defensa que tienen las bacterias y arqueobacterias para detectar virus y destruirlos. Por eso esperamos que el día de mañana CRISPR sirva también directamente para el tratamiento de infecciones. Pero por ahora queremos que nos ayude con su detección”, indica Pereyra-Bonnet.

El sistema CRIPSR cuenta con una proteína principal llamada Cas, de la que hay diferentes clases. Aunque para la edición génica se usa la Cas9, para la identificación del material genético de los virus, los investigadores se valen de la Cas12. Al igual que Cas9, Cas12 encuentra una secuencia específica de ADN para la que fue programada y produce un corte puntual, pero tras hacerlo realiza también una serie de cortes indiscriminados. Es esta última reacción la que se puede detectar mediante un lector de placas en un laboratorio o a través de la tira reactiva de papel de un kit portable.

La ventaja que ofrecen los test de diagnóstico en base a CRISPR es que se pueden adecuar sin grandes costos para detectar la presencia de cualquier virus, siempre y cuando se conozca su secuencia.

Desafíos por delante

Las muestras aportadas por el Anlis/Malbran que recientemente fueron procesadas con éxito llegaron en forma de lo que se conoce como ARN viral o material genético del virus. El aislamiento del ARN viral una vez que se realiza el hisopado nasofaríngeo (u otro tipo de extracción para una muestra respiratoria) es una tarea compleja y que requiere de importantes medidas de seguridad. Uno de los desafíos que se plantean los investigadores, complementarios con el perfeccionamiento del método de detección por CRISPR, es desarrollar un dispositivo portátil que permita también de forma rápida y segura poder separar el material genético a analizar.

“Lo óptimo sería poder desarrollar un dispositivo portátil completo de manera que la muestra pueda ser tomada y manipulada de forma segura por personal de salud. Para eso se tendría que poder aislar material del virus –en este caso del SARS-CoV-2, pero podría ser cualquier otro- sin necesidad de una cámara de bioseguridad o de un equipamiento muy sofisticado, para que se pueda hacer el diagnóstico por CRISPR”, explica la genetista Ivana Primost, investigadora del laboratorio de Biología Molecular del Hospital Municipal de Trauma y Emergencias Dr. Federico Abete (ubicado en la localidad bonaerense de Malvinas Argentinas) y especialista en diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas, quien también colabora con el proyecto CASPR y forma parte de la Unidad COVID19.

En este sentido uno de los pasos en los que están actualmente trabajando contra reloj es la búsqueda de un líquido (buffer) en el que se pueda depositar la muestra respiratoria cruda de forma tal que inactive el virus, pero al mismo tiempo no arruine la calidad del material extraído para hacer el testeo.

“Pensar que uno puede tomar un hisopado a un paciente y a la hora tener un resultado con la misma confianza que hoy otorga un estudio hecho por PCR es un desafío muy interesante y creo que lo vamos a lograr”, concluye Primost.