Monitoreo de la cepa Lactobacillus salivarius DSPV 001P de origen aviar por Electroforesis en Gel por Campos Pulsados.

BLAJMAN, J.E.; BERISVIL, A.P.; ROMERO SCHARPEN A.; ASTESANA D.M.; ZIMMERMANN, J.A.; CONTI G.; ROSMINI, M.R.; ZBRUN, M. V.; SEQUEIRA, G.J.; FRIZZO, L.S.

Casilda

Jornada; XVI Jornadas De Divulgación Técnico Científicas 2015 - III Jornadas Latinoamericanas FCV-UNR; 2015

Facultad de Cs. Veterinarias Universidad Nacional de Rosario

INTRODUCCIÓNLa técnica de Electroforesis en Gel por Campos Pulsados (PFGE) es considerada actualmente el ?gold standard? de los métodos de tipificación molecular. Esta técnica permite tipificar cepas de la misma especie, para así poder determinar diferencias genéticas entre ellas por medio de la digestión y separación de fragmentos de ADN1OBJETIVOEste experimento fue diseñado con la finalidad de comprobar si la cepa potencialmente probiótica Lactobacillus salivarius DSPV 001P administrada a pollos parrilleros presentaba diferencias con la que posteriormente se recuperaba desde el tracto gastrointestinal.MATERIALES Y MÉTODOSPara obtener el perfil genómico de todas las cepas (L. salivarius DSPV 001P identificada, L. salivarius DSPV 001P liofilizada, L. salivarius DSPV 001P recuperada desde buche y L. salivarius DSPV 001P recuperada desde ciego) se usó la metodología basada en PFGE. Los cultivos de cada una de las cepas crecidos en caldo MRS fueron centrifugados. El sedimento fue resuspendido en 1,8 ml de NaCl 0,85%. Un volumen de 150 µl de agarosa al 2% fundida fue adicionado a 150 µl de suspensión celular. Inmediatamente, la mezcla fue dispensada en los pocillos del molde para plugs, los cuales se dejaron solidificar en la heladera. Los plugs fueron transferidos a tubos falcon conteniendo buffer NET con lisozima e incubados en un baño termostatizado a 37 °C por 24 h. Seguidamente, cada plug se transfirió a un tubo falcon con buffer de lisis y se incubó a 37 °C durante 24 h. Para los lavados, se añadió 10 ml de buffer TE estéril, dejándose en baño termostatizado a 55 °C por 40 min (este paso de lavado se repitió en cuatro ocasiones)2. La digestión enzimática se realizó utilizando la enzima de restricción SmaI. Los fragmentos de ADN digeridos dentro de los plugs fueron separados mediante PFGE en un gel de agarosa al 2% en buffer TBE 0,5X. Una vez solidificado el gel, se incorporó cada muestra en una calle diferente y se aplicó encima una capa de agarosa al 2% como sellador. La electroforesis se llevó a cabo en un equipo de electroforesis en campo pulsado CHEF-DR III (Bio-Rad) con buffer TBE 0,5X bajo las siguientes condiciones: 6 V/cm (cambio de orientación inicial 5 s, cambio de orientación final 35 s) durante 18 h a 14 °C. Después de la electroforesis, los geles fueron teñidos 30 min en bromuro de etidio. La imagen fue capturada y finalmente guardada para su interpretación posterior. RESULTADOSEl coeficiente de similitud entre L. salivarius DSPV 001P identificada, L. salivarius DSPV 001P liofilizada, L. salivarius DSPV 001P recuperada de buche y L. salivarius DSPV 001P recuperada de ciego fue del 100%. Todas las muestras presentaron un idéntico patrón de restricción, en tamaño y número de fragmentos.CONCLUSIÓNLa técnica PFGE permitió inferir que todos los aislamientos tenían la misma procedencia, y es una técnica adecuada para el monitoreo in vivo de cepas probióticas, ya que posee alto poder discriminatorio, sus resultados son reproducibles y es de rápida ejecución y comparación.