Identificación de Actinobacillus pleuropneumoniae mediante un ensayo de PCR basado en la amplificación del gen OmlA

ZBRUN, M. V.; ZEQUIN, L.; VANZETTI, L.S.; ZIELINSKI, G. C.

Córdoba

Congreso; V Congreso Nacional de Producción Porcina, XIV Jornadas de Actualización Porcina; 2006

Universidad Nacional de Rio Cuarto

Introducción:  La pleuroneumonía porcina es una enfermedad difundida en todo el mundo y caracterizada por provocar alta mortalidad, reducción de la producción y aumento en los costos de producción de los establecimientos afectados. Clínicamente se caracteriza por producir un cuadro neumónico severo asociado a pleuritis fibrinosa que a la primoinfección puede afectar a todas las categorías del establecimiento. Esta enfermedad es producida por Actinobacillus pleuropneumoniae(App), bacteria gram negativa, NAD dependiente (biovariedad 1). A su vez, ésta biovariedad fue subdividida en 15 serotipos de acuerdo a sus antígenos de superficie (LPS y polisacáridos de membrana). Este trabajo tuvo como principal objetivo la identificación de Actinobacillus pleuropneumoniae mediante la amplificación por PCR del gen omlA que codifica para una proteína de membrana externa, común a todos los serotipos de la biovariedad 1. Ésta técnica, descripta por varios autores (Savoye et al, 2000) permite hacer una identificación rápida y específica del patógeno, obviando o perfeccionando mas trabajosas técnicas bacteriológicas convencionales de identificación taxonómica. Materiales y métodos: Cepas bacterianas: Se utilizaron 9 serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae (cepas de referencia internacional), existentes en el cepario del Laboratorio de Bacteriología del grupo de Sanidad Animal de la EEA M. Juárez. También se utilizaron 6 cepas de campo de establecimientos de la zona identificadas a través de pruebas bioquímicas cómo App. Como control negativo para la prueba se utilizó una cepa de Staphilococcus aureus  y una cepa de campo de Haemophilus parasuis  filogenéticamente relacionada con el patógeno. Se las sembró en caldo M96 y agar sangre (suplementado con NAD) realizándose la incubación a 37ºC durante 48 hs en aerobiosis. Extracción del ADN: para la obtención del ADN bacteriano, se utilizó la técnica descripta por  Gram et. al. (2000) con modificaciones, partiendo de cultivos puros del microorganismo. Las muestras fueron mantenidas a -20ºC hasta su uso. Primers: para la amplificación del gen omlA se utilizaron los oligonucleótidos LPF y omlAR publicados por Savoye, et. al. (2000). Condiciones de la PCR: se utilizó el protocolo descrito por Fitipaldi et. al (2003), con modificaciones. Se preparó la reacción en 25 μl totales, utilizando 2 μl de ADN por  muestra con 35 ciclos de amplificación,. Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio, documentados por medio de una cámara digital. Para determinar el tamaño de las bandas se usó un marcador de 100pb (Invitrogen). Resultados y discusión: En los 9 serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae utilizados en el ensayo, se obtuvo el fragmento esperado de 950pb correspondiente al gen omlA (figura 1). En las 6 cepas de campo, identificadas bioquímicamente como Actinobacillus pleuropneumoniae se visualizó un fragmento de amplificación del mismo tamaño (no mostrado). En los controles negativos no se observó la amplificación del fragmento génico elegido.  De acuerdo a la bibliografía consultada y a los resultados obtenidos en éste trabajo consideramos que ésta técnica de PCR es útil  como herramienta para hacer una rápida  identificación de Actinobacillus pleuropneumoniae. Además se podría utilizar como paso previo para montar un PCR Multiplex  que permita agrupar en serotipos a aislamientos de éste microorganismo, muy importante en la epidemiología de la enfermedad.