Caracterización de sistemas CRISPR-Cas en lactobacilos del grupo casei

PUJATO SILVINA ALICIA; GALLIANI VALENTINA; BRIGGILER MARCÓ, M.; QUIBERONI ANDREA; MERCANTI, DIEGO

Buenos Aires

Congreso; CAM; 2019

Los sistemas CRISPR-Cas pueden considerarse sistemas inmunológicos de bacterias y arqueas, ya que degradan eficazmente ADN extraño (fagos, plásmidos) que ingresa a la célula. Estos sistemas consisten en arreglos de secuencias de ADN repetitivas, cortas y muy conservadas (repeticiones), intercaladas con secuencias variables (espaciadores), correspondientes a regiones de ADN foráneo, principalmente de virus o plásmidos, que son incorporadas en los sistemas CRISPR durante el proceso de infección.La adquisición de estos fragmentos otorga a la bacteria inmunidad específica y heredable en las siguientes generaciones celulares. Tanto la adquisición de espaciadores como el proceso efector de la inmunidad son llevados a cabo por genes asociados a CRISPR, denominados cas (CRISPR associated). Por lo tanto, un sistema de defensa activo debe poseer tanto secuencias CRISPR como genes cas (CRISPR-Cas). Estos sistemas, activos y profundamente estudiados en Streptococcus thermophilus, han sido escasamente analizados en otros géneros y especies de BAL. El objetivo planteado para este trabajo fue estudiar la presencia y diversidad de sistemas CRISPR-Cas en los genomas de cepas de lactobacilos del grupo casei, el cual comprende numerosas cepas reconocidas como probióticas.En primer lugar se diseñaron primers específicos sobre secuencias nucleotídicas conservadas en cepas de lactobacilos del grupo casei. Luego, utilizando dichos primers y mediante amplificación por PCR se verificó la presencia de sistemas CRISPR-Cas del tipo IIA en 21 cepas (17 de Lb. paracasei y 4 de Lb. rhamnosus) de las 40 de nuestra colección. Los fragmentos amplificados fueron secuenciados (Macrogen, Corea) y sobre dichas secuencias se fueron diseñando nuevos primers y amplificando por PCR, repitiendo este ciclo hasta obtener las secuencias completas de toda la zona CRISPR, incluyendo los genes cas.Las repeticiones encontradas para los sistemas tipo IIA fueron conservadas entre cepas de Lb. paracasei y de Lb. rhamnosus, con solo 3 bases distintas de un total de 36. El número de repeticiones encontrado para las distintas cepas fue variable (10 a 26). Del total de cepas positivas, 5 de Lb. paracasei y 2 de Lb. rhamnosus presentaron repeticiones homólogas a secuencias reportadas de plásmidos y fagos. Los resultados obtenidos indican que los sistemas CRISPR hallados en las 21 cepas de Lb. paracasei y Lb. rhamnosus podrían estar activos ya que poseen regiones CRISPR completas, y para algunos de ellos se confirmó que poseen espaciadores homólogos a fagos y plásmidos de lactobacilos. Posteriores estudios de interferencia se utilizarán para confirmar si los sistemas CRISPR detectados se encuentran efectivamente activos.