Sistemas CRISPR-Cas en Lacticaseibacillus: Una solución natural para la industria fermentativa.

PUJATO, S.; SIMONUTTI, A.; MOINEAU, S.; ROUSSEAU, G.; MERCANTI, D.; QUIBERONI, A.

Buenos Aires

Jornada; II JORNADAS LATINOAMERICANAS DE BACTERIÓFAGOS; 2022

Universidad Nacional de José C. Paz

La industria láctea fermentativa se basa fundamentalmente en la actividad de las bacterias lácticas. Durante los procesos de elaboración, la actividad de las bacterias del starter puede verse retrasada por bacteriófagos. El ataque por dichosbacteriófagos causa la destrucción de las células bacterianas, obstaculizando el normal crecimiento y desarrollo de acidez por parte de los fermentos.Los sistemas CRISPR confieren inmunidad “adquirida”, específica de secuencia y heredable, frente a fagos y a otros elementos genéticos que resulten extraños e invasivos para la célula bacteriana, como por ejemplo los plásmidos. Un locus CRISPR está compuesto por secuencias cortas de ADN repetidas y altamente conservadas dentro de la agrupación, separadas por secuencias variables conocidas como espaciadores. El proceso de inmunización se basa en la incorporación de nuevos espaciadores en el locus CRISPR, provenientes de secuencias de fagos o plásmidos. Posteriormente, los CRISPR son transcriptos en pequeños ARN (crARNs) que guían a un complejo de proteínas para cortar material genético “invasor” (Pujato y col, 2021). A pesar de la popularidad de la edición genómica basada en CRISPR-Cas9, hasta la fecha se han caracterizado pocos sistemas CRISPR endógenos.El objetivo del presente trabajo fue seleccionar bacterias con potencial probiótico que contengan sistemas CRISPR-Cas activos y explorar la posibilidad de aprovechar esta tecnología de inmunización natural, con el fin de proveer a la industria una herramienta ‘food-grade’ para el desarrollo de cultivos mejorados en su fagorresistencia. Para ello, se analizó la presencia de sistemas CRISPR-Cas de 49 cepas de Lacticaseibacillus perteneciente a la colección del INLAIN, secuenciándose 14 sistemas CRISPR-Cas. Para evaluar la funcionalidad del sistema CRISPR-Cas, se realizaron ensayos de interferencia, utilizando el plásmido pNZ123 más un inserto que contenía el primer espaciador de la cepa y la secuencia PAM (Motivo Adyacente al Protoespaciador) correspondiente al sistema CRISPR analizado.El 52 % de las cepas de Lacticaseibacillus analizadas presentaron sistemas CRISPR-Cas en su genoma. De los 14 sistemas CRISPR- Cas secuenciados, 13 fueron sistemas CRISPR-Cas tipo II-A, evidenciándose entre 21 y 49 espaciadores. El 5 % de los espaciadores fueron similares a genomas fágicos o plásmidos. Solo 1 cepa presentó sistema CRISPR tipo IE, con 79 espaciadores no reportados previamente. El 23 % de estos mostró una homología del 100 % con secuencias de fagos de Lb. paracasei.Los ensayos de interferencia evidenciaron una alta funcionalidad del sistema CRISPR-Cas en las cepas de Lacticaseibacillus estudiadas. El sistema CRISPR tipo II-A mostró una mayor actividad del sistema en comparación con el sistema I-E. Estos resultados son prometedores, ya que la demostrada funcionalidad del sistema CRISPR permitiría obtener cepas probióticas de Lacticaseibacillus con la resistencia a fagos mejorada