Análisis de la diversidad microbiana en gránulos de kefir mediante DGGE

HAMET M F, LONDERO A, REY F, DE ANTONI, G L, GARROTE G L, ABRAHAM A G

Rosario

Jornada; XIII Jornadas Argentinas De Microbiología.; 2008

AAM

Diferentes especies de levaduras y bacterias ácido lácticas coexisten en simbiosis en los gránulos de kefir. Se ha descrito que según el origen de los gránulos la microflora presente puede variar, provocando un cambio en las propiedades funcionales y sensoriales de cada leche fermentada. La electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE) se ha empleado para estudiar la diversidad de poblaciones microbianas complejas. Los objetivos del presente trabajo fueron optimizar y analizar la factibilidad del uso de DGGE para estudiar la variabilidad microbiológica de gránulos de kefir de diferentes orígenes. Se trabajó con 9 gránulos de kefir de la colección CIDCA de los cuales se extrajo el DNA total de bacterias y levaduras por distintos procedimientos. Para la purificación se utilizó el kit Accuprep Genomic DNA (BIONNER). También se obtuvo DNA de cultivos puros de bacterias (Lactobacillus kefiranofaciens DSMZ 5016, L.kefir ATCC 8007, L. parakefir DSMZ 1055 y L. casei DSMZ 20011) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae, S. unisporum, Kluyveromyces marxianus y K. lactis) para ser utilizadas como patrón de referencia. Los productos PCR para el análisis en DGGE se obtuvieron utilizando los oligonucleótidos sintéticos LS2 y GC-NL1 para levaduras y 518r y GC-338f para bacterias que amplifican un segmento del extremo 5´ del gen 26S rDNA y 16S rDNA respectivamente. Se ensayaron 5 técnicas de extracción, dos programas de amplificación y distintos gradientes desnaturalizantes. Los geles se tiñeron con SYBR gold y se realizó un análisis de agrupamiento utilizando el programa Gel-Compare. En base al número e intensidad de bandas obtenidas se eligió el procedimiento de extracción de DNA que incluye la disolución previa del polisacárido de kefir y las siguientes condiciones de amplificación: 94°/5 min; 94°/30 seg, 60°/60 seg., 72°/30 seg. por 35 ciclos y 72°/5 min para bacterias y 95°/5 min; 95°/60 seg, 60°/45 seg., 72°/60 seg. por 30 ciclos y 72°/7 min para levaduras. Para obtener una buena separación de bandas se adoptaron gradientes desnaturalizantes de urea y formamida 30:70 y 40:60 para levaduras y bacterias respectivamente, corridas electroforéticas de 16 horas, 100 Voltios y a 60°C en ambos casos. De esta manera, pudo observarse que seleccionando adecuadamente las condiciones de extracción, amplificación y separación se detectan diferencias en los distintos gránulos al analizar los perfiles para bacterias y levaduras, constituyendo la técnica de DGGE una herramienta útil para evaluar las diferencias en la composición de la microflora de kefir.