PCR en tiempo real para la detección de Clostridium difficile toxigénico.

133 BARIDÓN, A.; RAHHAL, M.; CARBONE, R.; PÉREZ, F.; PÉREZ, P. F. Y TREJO, F. M.

Jornada; XXIX Jornadas Científicas del Hospital Prof. Dr. R Rossi.; 2014

Introducción: La infección por Clostridium difficile (C. difficile) productor de toxinas es la causa principal de diarrea asociada al uso de antibióticos en el ambiente hospitalario. Puede producir desde diarrea leve hasta colitis pseudomembranosa y perforación colónica; además de producir brotes por contacto. Dichas patologías se hallan asociadas a la producción de dos toxinas, TcdA (306 kDa) y TcdB (260 kDa), siendo esta última el principal factor de virulencia presente en todas las cepas toxigénicas. Su detección es importante para otorgar tratamiento oportuno, disminuir complicaciones y evitar contagio de contactos. El método de referencia (gold standard) para la detección de toxinas de C. difficile es el ensayo de citotoxicidad sobre células eucariotas en cultivo. Éste requiere de al menos 48 hs para la lectura del resultado por lo que no es utilizado en el diagnóstico clínico rutinario. Otros métodos disponibles para la detección de toxinas y antígenos de C. difficile se comercializan en formato de ELISA o inmunocromatograficos, alguno de los cuales presentan baja sensibilidad y especificidad; todos ellos de elevado costo por ser de origen importado. La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica rápida, muy sensible y específica para la detección de toxinas de C. difficile en muestras de materia fecal. Distintas publicaciones recomiendan el uso de esta técnica dentro de un algoritmo diagnóstico para C. difficile. El HIGA R. Rossi de La Plata realiza Trasplante de Células Hematopoyéticas Progenitoras, por ende, hay una gran población de pacientes con diversos grados de inmunosupresión que son vulnerables a cualquier tipo de infección. Además posee otras unidades de cuidados intensivos donde es frecuente la antibioticoterapia prolongada y episodios de diarrea asociados a la misma. Actualmente en el Hospital no se dispone de un método diagnóstico para C. difficile. Objetivo: Validación analítica de una PCR en tiempo real in house para la detección del gen de la toxina B (tcdB) de C. difficile comparado con el método de referencia realizado por la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata, a través de un proyecto de extensión universitario. Materiales y métodos:. Se utilizó como cepa control C. difficile ATCC 9689. Se testearon diluciones decimales del ADN extraído de la cepa control con las cuales se infectó un pool de materia fecal para evaluar la sensibilidad analítica. Además se trabajo con materia fecal proveniente de pacientes con sospecha clínica de infección por de C. difficile. Las mismas fueron alicuotadas en 2 eppendorf para realizar la PCR en tiempo real en nuestro centro y el ensayo de citotoxicidad en la Facultad. Las muestra fueron sometidas a un proceso de extracción de ADN mediante un kit comercial de columnas (Zimo Research-según especificación del fabricante). Además se utilizaron cepas de C. difficile no toxigénica y de C. perfringes toxigénico para evaluar la especificidad analítica. Se realizó una PCR en tiempo real utilizando cebadores y sonda correspondientes a una región conocida, no repetitiva de la secuencia que codifica para TcdB. Estos fueron enfrentados contra la biblioteca genómica a fin de corroborar que no hay reacción cruzada con otras especies. Los parámetros de ciclado se establecieron según especificaciones del fabricante de la mezcla de reacción y experiencia previa.Resultados: Se detectó amplificación hasta 100 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) de C. difficile por ml de materia fecal diarreica. Se obtuvo un rango dinámico de 6 órdenes de magnitud. No se observó amplificación con las cepas de C. difficile no toxigénica y de C. perfringens toxigénico. Discusión: La PCR es una alternativa apropiada para la detección y confirmación de TcdB de C. difficile en materia fecal no solo por su alta sensibilidad y especificidad sino también por su buena correlación con el método de referencia. De acuerdo con los resultados satisfactorios obtenidos en la validación analítica, el paso siguiente es la validación biológica con materia fecal de pacientes con sospecha clínica de infección por de C. difficile; la cual ya se está llevando a cabo en conjunto con la Facultad. Siendo la PCR para la detección de TcdB una técnica confirmatoria y dado que en nuestro hospital no se dispone de ningún otro método diagnóstico es sumamente importante contar con esta determinación para instaurar medidas tempranas para evitar complicaciones en individuos afectados y el contagio de contactos, así como también disminuir el gasto hospitalario.Conclusión: Se logró optimizar una PCR en tiempo real con buena sensibilidad analítica debido a que detecta 100 UFC/ml de materia fecal, se obtuvo un amplio rango dinámico y presentó buena especificidad, ya que no hubo amplificación cuando se infectó con las otras cepas.