Clostridium difficile: estudio sobre la esporulación y respuesta al taurocolato de aislamientos toxigénicos.

SOLDAVINI-PELICHOTI, P. C.; TREJO, F. M. Y PÉREZ, P. F.

Jornada; XVII Jornadas Argentinas de Microbiología y Jornadas Bioquímicas del Sur Argentino.; 2017

Clostridium difficile es un anaerobio estricto esporulado asociado a diarreas desencadenadas por el uso de antibióticos. Su virulencia está relacionada a la producción de toxinas proteicas (TcdA, TcdB y toxina binaria) que dan lugar a un efecto inflamatorio grave pudiendo llegar a cuadros de colitis pseudomembranosa. Los esporos son cruciales para la diseminación de la enfermedad y su resistencia a factores ambientales y agentes desinfectantes dificulta el control de la patología. Una vez ingeridos, su germinación en el tracto digestivo da lugar a las formas vegetativas que producen las mencionadas toxinas. El objetivo del presente estudio fue la determinación de la capacidad de esporulación de cepas de C. difficile en diferentes condiciones así como la respuesta de estos esporos al taurocolato, el germinante natural para esta bacteria.Se utilizaron las cepas toxigénicas ALCD3, VPI 10463, GCD2, GCD4 y 117, crecidas en medio BHI líquido (0,05 % cisteína) a 37°C en anaerobiosis. Los esporos se produjeron en medio DRCM sólido (37°C, 7 días), se cosecharon con agua destilada y se purificaron por centrifugación sobre sacarosa 50% (p/v). La germinación se evaluó por medidas de absorbancia (A600nm) en presencia de taurocolato de sodio (50, 100 y 150mM). Para evaluar la esporulación, las bacterias se crecieron en BHI líquido (0,05% cisteína) o ágar DRCM y se determinaron las proporciones de bacterias con esporos en fase oscura (estadíos tempranos) y brillantes (estadíos avanzados) así como también la cantidad de esporos libres.El crecimiento en BHI seguido por medidas de A 600 nm mostró períodos de latencia entre 3 y 6 h y tiempos de generación de alrededor de 1 h para todas las cepas ensayadas. Las formas esporuladas comenzaron a detectarse a las 24 h (fase oscura) para todas las cepas, con un rápido pasaje a fase brillante y esporo libre para la cepa ALCD3 tanto en medio sólido como en medio líquido. Las cepas con cinéticas de esporulación más lenta fueron la GCD4 y la VPI 10463 que, aún a los 5 días de incubación en medio líquido, presentaron mayoría de esporos en fase oscura (80% y 83% respectivamente).En relación a la germinación en presencia de taurocolato de sodio, estudios a diferentes concentraciones mostraron mayor respuesta en la cepa ALCD3 con un marcado descenso de la A 600nm (41% del valor inicial) aún a concentraciones bajas del germinante (50 mM). A concentraciones mayores de taurocolato (150 mM), la cepa ALDC3 mantuvo su alta respuesta (al menos 37 %), las cepas GCD2 y 117 presentaron valores de disminución de DO de 31 y 22 % respectivamente mientras que las cepas GCD4 y VPI 10463 mostraron valores de 9 % y 8% respectivamente.Los resultados evidencian una amplia variedad de capacidad de esporulación y de germinación en cepas de C. difficile productoras de toxinas. Estas características resultan cruciales para la capacidad de producir enfermedad y la potencialidad de diseminación de este importante patógeno nosocomial.