Desarrollo de una estrategia de colaboración para contribuir al diagnóstico de diarreas asociadas a Clostridium difficile.

TREJO, F. M.; RUSCONI, M. E.; GUZZETTI, L.; SERRADELL, M. A.; HUMEN, M. A., ZAMBONI, M. I.; GUARDATI, M. C.; LEJONA, S.; ROLLET, R. Y PÉREZ, P. F.

Córdoba

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología.; 2007

<i>Clostridium difficile</i>, es el principal responsable de diarreas en pacientes cuya flora intestinal ha sido alterada por la administración de antibióticos o antineoplásicos. Produce las toxinas TcdA (enterotoxina) y TcdB (citotoxina). Existen diferentes métodos de diagnóstico que van de la detección de toxinas empleando kits inmunológicos comerciales (de alto costo), a ensayos de PCR. El objetivo fue implementar una estrategia de colaboración entre distintos grupos para contribuir al diagnóstico de diarreas asociadas a <i>C. difficile</i>. El trabajo tuvo 3 ejes: ensayos biológicos, PCR (tdcB) y ensayos inmunológicos. Como método de referencia para la detección de TcdB se ensayó la citotoxicidad sobre células Vero. Se analizaron muestras de heces de pacientes con antecedentes de tratamiento antibiótico y sospecha de colitis pseudomembranosa y muestras de hamsters infectados con <i>C. difficile</i> toxigénico. De cada muestra humana, una parte se usó para la PCR y el resto se diluyó en buffer y se filtró (0.45 um). Sobre diluciones seriadas de los sobrenadantes (SN) se ensayó la actividad citotóxica y la presencia de TcdA y TcdB (dot blot con anticuerpos monoclonales comerciales). Las muestras de animales fueron sometidas al ensayo biológico y dot blot. La purificación de toxinas se hizo con la cepa ATCC 9689 crecida en BHI. El sobrenadante de cultivo se concentró con membrana de 10kDA y se sembró en una columna de intercambio aniónico. La producción de toxinas de esta cepa se comparó con aislamientos clínicos. Los resultados de muestras de hamsters en el ensayo biológico mostraron la capacidad de distinguir positivos de negativos sin neutralizar toxinas con anticuerpos. En muestras de origen humano, la presencia de TcdB (dot blot) en los filtrados fecales correlacionó con marcado efecto citopático sobre células Vero (título>4000). Muestras negativas presentaron efecto nulo o bajos títulos (<16). Se observaron divergencias entre resultados de PCR para TcdB y efecto biológico que pueden explicarse por deleción de secuencias en el genoma. En la purificación de toxinas lograron separarse diferentes fracciones y algunas son reactivas sólo con el anticuerpo para TcdA. Se observan diferentes títulos de toxinas (dot blot y citotoxicidad) en cepas de diferentes orígenes. Las condiciones de los ensayos de citotoxicidad, PCR y dot blot resultan adecuadas para desarrollar estrategias de diagnóstico de <i>C. difficile</i> en nuestro país. El análisis de un mayor número de muestras permitirá la validación de métodos alternativos como la PCR y el dot blot en referencia al estándar aceptado para TcdB que es el ensayo de citotoxicidad. Los avances en la purificación de TcdA permitirán generar anticuerpos para implementar métodos inmunológicos alternativos para el diagnóstico.