Estrategias de aislamiento y caracterización de Lactobacillus kefiranofaciens

HAMET F.; LONDERO A; PIERMARÍA J.; GARROTE G.L.; ABRAHAM A

Córdoba

Congreso; III Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos Córdoba 2009 (CICyTAC 2009); 2009

Ministerio de Ccia y Tecnología de la provincia de Cordoba y otros

En los gránulos de kefir bacterias y levaduras se encuentran inmersas en una matriz formada por  proteínas, exopolisacárido (kefiran) y agua. El kefiran tiene características interesantes tanto funcionales como biológicas: es espesante, forma criogeles, películas y antagoniza factores extracelulares de patógenos. Está descripto que Lactobacillus kefiranofaciens es el microorganismo que lo produce. Este lactobacilo es anaerobio estricto y su aislamiento a partir de gránulos es dificultoso. El objetivo del trabajo consistió en aplicar diferentes técnicas para aislar e identificar L. kefiranofaciens. Para el aislamiento se utilizaron tres técnicas de disgregación de gránulos de kefir: ruptura con ultraturrax, congelamiento y corte mecánico y disolución del gránulo en agua a 40°C. A partir de cada una de las suspensiones se realizaron aislamientos directos por estrías en agar y con previo enriquecimiento en medio líquido (MRS pH 5, 7 días y anaerobiosis).  En base a las características macro y microscópicas de las colonias aisladas se seleccionaron siete microorganismos que resultaron Gram positivos, catalasa negativos y con capacidad de fermentar la leche a 30°C en anaerobiosis. Se realizó la evaluación reológica de las correspondientes leches fermentadas en un reómetro Haake Rheostress 600 en modo rotacional incluyendo leche fermentada por L. kefiranofaciens como control. Los perfiles de proteínas totales se analizaron mediante SDS-PAGE. Para constatar la presencia de L. kefiranofaciens dentro de la microbiota total (cultivable y no cultivable) del gránulo se utilizó electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). Para ello se extrajo DNA total de gránulo, bacterias seleccionadas y de referencia (L. kefiranofaciens DSMZ 5016, L. kefir ATCC 8007, L. parakefir DSMZ 1055 y L. cassei DSMZ 20011, L. kefirgranum JCM 8572, L. plantarum 337, L. delbruki subsp bulgaricus CIDCA 332) y se los sometió a la reacción de polimerización en cadena. El análisis de DGGE mostró en el gránulo de kefir bandas coincidentes con las de L. kefiranofaciens, al igual que cinco de los aislados analizados (1 ,2 ,3 ,5 y 6), de los cuales tres (2, 5 y 6) presentan además otras bandas. El aislado 4 mostró un perfil característico de L. cassei. En cuanto al perfil de proteínas totales, los aislados 1, 3, 5 y 6 son coincidentes; 4 y 7 difieren entre sí y con el grupo anterior. Todas las leches fermentadas mostraron comportamiento pseudoplástico con la presencia de importantes áreas de histéresis. Los valores de viscosidad aparente a 500s-1 de las mismas variaron entre 22,9 y 36,0mPa.s y las áreas de histéresis entre 2018 y 9680Pa/s. De esta manera, la metodología aplicada permitió diferenciar tres grupos de lactobacilos, uno de los cuales presenta semejanzas con L. kefiranofaciens. Las coincidencia en los perfiles de bandas observados por DGGE debe ser corroboradas mediante secuenciación para asignar inequívocamente la identidad de estas cepas.