Optimización de la técnica PMA-qPCR para cuantificación de Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) viable en hamburguesas de carne vacuna

REY, M.A.; CAP, M.; VAUDAGNA, S. R; MOZGOVOJ, M.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Taller; Primer Taller Biotecnología Aplicada a la Tecnología de Alimentos; 2019

Facultad Regional Buenos Aires UTN

El PMA (propidium monoazide) es un colorante que se intercala entre las hebras de ADN de forma irreversible impidiendo su amplificación por PCR. La membrana bacteriana es impermeable al colorante por lo que este sólo puede penetrar células cuyas membranas se encuentren comprometidas y complejarse con el ADN gracias al paso de fotoactivación con luz azul LED. El complejo PMA-ADN así formado inhibe la acción de la polimerasa. De esta forma, la señal obtenida por qPCR solo es atribuible a células viables remanentes post tratamiento de inactivación bacteriana.El objetivo del presente trabajo fue poner a punto la técnica PMA-qPCR para evaluar viabilidad de STEC en hamburguesas de carne vacuna. Para ello, se determinó la concentración mínima de PMA necesaria para inhibir la señal de bacterias muertas y la influencia del PMA en la amplificación de ADN de distintas concentraciones de bacterias vivas. En ensayos posteriores se verificó la capacidad de discriminar bacterias viables en un rango de concentraciones en presencia de una alta concentración de bacterias muertas inactivadas por calor, tanto en cultivo como en hamburguesa. La cepa seleccionada para los ensayos fue STEC O157:H7 (EDL 933). El PMA se incorporó a las muestras junto con el PMA enhancer y se sometió a la fotoactivación durante 15 min. Luego se realizó la extracción de ADN mediante kit comercial y se amplificó un fragmento del gen stx2 por PCR en tiempo real.La concentración de PMA necesaria para anular la señal de 5 log UFC/ml de bacterias muertas fue de 100 μM, concentraciones más altas no pudieron ser inhibidas con esta cantidad de colorante. Se demostró que el PMA no afectaba la señal de bacterias vivas comparando los valores de Ct (cycle treshold, ciclo umbral de señal) obtenidos entre un grupo de muestras con concentraciones crecientes de bacterias vivas (3 a 6 log UFC/ml) tratadas y sin tratar con el colorante. Los valores de Ct no variaron significativamente entre estos dos tipos de muestras por lo que se corroboró que el colorante no pudo penetrar las membranas bacterianas intactas. La capacidad de discriminar entre bacterias vivas y muertas se evaluó preparando un grupo de 9 muestras conteniendo 5 log UFC/ml de bacterias muertas combinadas con concentraciones crecientes de células vivas, desde 1 hasta 7 log UFC/ml, primero en cultivo y luego en homogenato de hamburguesa de carne vacuna. Los resultados de las muestras tratadas con PMA 100 μM mostraron una disminución del Ct consistente con el aumento de la concentración de células vivas, habiéndose anulado la señal de las bacterias muertas en cada una de las mezclas. Esto evidencia la capacidad del PMA para discriminar células viables de no viables, tanto en cultivo como en hamburguesa.La técnica de PMA-qPCR resulta una alternativa novedosa y con gran potencial para detectar viabilidad de STEC en hamburguesas que hayan sido tratadas para inactivar este microorganismo.