Cuantificación de Escherichia coli productora de toxina shiga viable en hamburguesas de carne vacuna mediante PMA-qPCR

REY, M.A.; CAP, M.; VAUDAGNA , S. R.; MOZGOVOJ, M.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Simposio; VI Simposio Latinoamericano de Inocuidad Alimentaria IAFP.; 2018

Asociación Argentina de Microbiología

El PMA (propidium monoazide) es un colorante que se intercala en el ADN de bacterias muertas e inhibe su amplificación. Su selectividad se fundamenta en que la membrana bacteriana es impermeable al colorante por lo que sólo puede penetrar células cuyas membranas se encuentren comprometidas. Una vez en el interior de la célula, se une al ADN irreversiblemente intercalándose entre las bases y formando un complejo PMA-ADN por efecto de la fotoactivación con una fuente de luz azul LED. Este complejo impide que el ADN sea amplificado por PCR. El objetivo del presente trabajo fue optimizar la técnica PMA-qPCR para evaluar viabilidad de STEC en hamburguesas de carne vacuna.Para los ensayos se utilizaron hamburguesas de 10 g inoculadas con células de STEC, se realizaron homogenatos adicionándoles 90 ml de Agua Peptona 0,1%. En un primer ensayo, se inocularon hamburguesas sólo con células viables para lograr una concentración final en homogenato de 10^7 y 10^4 UFC/ml. A una alícuota de cada concentración se la trató con PMA 100 µM, dejando otra alícuota como control sin tratamiento. Para un segundo ensayo, se utilizó la concentración de 10^4 UFC/ml de células inactivadas por calor (muertas) y de células viables (vivas). Combinaciones de estos dos inóculos fueron utilizadas para inocular otras tres hamburguesas en relación vivas:muertas de 75:25, 50:50, 25:75. También fueron tratadas con PMA 100 µM y se incluyó un duplicado sin tratamiento con colorante. La extracción de ADN de los homogenatos fue realizada con kit comercial. La qPCR utilizada fue la descripta en la norma ISO 13136:2012.Los valores de Ct (cycle treshold) obtenidos para las muestras de células vivas con y sin tratamiento con PMA dieron valores semejantes, mostrando que el colorante no ingresó en dichas células. Las hamburguesas inoculadas con células muertas y tratadas con PMA no dieron señal de amplificación por qPCR. En las hamburguesas inoculadas con mezclas de células vivas y muertas, y tratadas con PMA, se observaron valores consistentes a la concentración de células vivas (Ct más alto en aquellas muestras con menor proporción de células vivas). En el caso de las muestras sin tratar con el colorante, los valores de Ct fueron similares en todos los casos independientemente de la relación vivas: muertas utilizada. El PMA inhibió completamente la señal correspondiente al ADN de células muertas, por lo que en las mezclas de bacterias muertas y vivas, la señal obtenida es atribuible sólo a estas últimas. Además, el PMA no afectó la señal correspondiente al ADN de bacterias vivas inoculadas en las hamburguesas. Para el caso de las muestras sin tratar con PMA, los valores de Ct fueron similares lo que evidencia la imposibilidad de discernir entre células viables y no viables mediante qPCR ante la ausencia del colorante. Basándonos en los resultados obtenidos, esta técnica resulta promisoria para cuantificar bacterias viables y evaluar efectividad de diversos tratamientos de inactivación de STEC.