PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN PARCIAL DE LA ENZIMA FITASA DE LACTOBACILLUS PLANTARUM CRL 1964

SANDEZ PENIDEZ S H, VELASCO MANINI M A, GEREZ C L, ROLLÁN G C.

VIRTUAL

Congreso; IV Reunión Conjunta de Sociedades de Biología.; 2020

Los cereales y seudocereales constituyen una importante fuente de nutrientes y oligoelementos, pero su biodisponibilidad en animales monogástricos es baja debido a la presencia de fitato (mio-inositol hexafosfato, IP6), un compuesto antinutricional por su capacidad de quelar cationes y proteínas. Fitasa es la enzima que hidroliza IP6, liberando intermediarios inositol fosfato (penta a mono inositol fosfato), minerales/proteínas acomplejados y fósforo inorgánico. En estudios previos, Lactobacillus (L.) plantarum CRL 1964 fue seleccionado entre 73 cepas de bacterias lácticas (BL) aisladas de seudocereales por presentar la mayor actividad fitasa asociada a un óptimo crecimiento en medio de cultivo MRSm en presencia de IP6. La enzima fitasa de L. plantarum CRL 1964 (PhyLp) fue parcialmente caracterizada. La purificación de PhyLp es de gran importancia ya que permitiría realizar estudios cinéticos, de especificidad de sustrato y moleculares y, de esta manera ampliar el conocimiento de fitasas en BL, tema aún poco dilucidado. Asimismo, la enzima purificada se podría incluir en la preparación de alimentos con alto contenido de fitato y destinado a animales monogástricos. En base a lo expuesto, el objetivo de este trabajo fue purificar la enzima fitasa de L. plantarum CRL 1964 y evaluar su especificidad de sustrato. A fin de purificar la enzima se utilizó precipitación fraccionada con (NH4)2SO4 y cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G-100). La especificidad de sustrato de PhyLp fue determinada, evaluando su actividad frente a diferentes sustratos fosforilados [glucosa-1‐fosfato, p‐nitrofenil fosfato (p-NPP), piridoxal 5′‐fosfato, nicotinamida adenina dinucleotido fosfato y fitato de sodio]. Los resultados pusieron en evidencia que la mayor actividad fitasa se determinó en la fracción de saturación del 30 % de sulfato de amonio. Esta fracción se aplicó a una columna de Sephadex G-100, obteniéndose un pico único de actividad (312.97 U mg prot -1). PhyLP se purificó aproximadamente 519.25 veces con una recuperación del 3.63 %. El análisis por SDS-Page reveló dos bandas proteínas (M1 = 55 kDa y M2 = 60 kDa) en la fracción activa. Sin embargo, el análisis de zimograma reveló actividad fitasa en la banda de 55 kDa. PhyLp mostró alta especificidad para IP6 (100.00 ± 3.47%) con respecto a otros sustratos fosforilados evaluados, incluyendo el sustrato común de fosfatasas p-NPP (15.99 ± 1.54%). Estos resultados indican que PhyLp es una verdadera fitasa y no una fosfatasa inespecífica. El empleo de L. plantarum CRL 1964 como cultivo iniciador o la adición directa de su PhyLP permitirá incrementar el valor nutricional de productos a base de cereales/seudocereales y representa una interesante y novedosa alternativa biotecnológica para la industria alimentaria.