Caracterización de una feruloil esterasa de Lactobacillus fermentum

ABEIJÓN MUKDSI, M.C.; PLAZA VINUESA L.; MEDINA, R.; MUÑOZ, R.; DE LAS RIVAS, B.

Madrid

Simposio; 13ª REUNIÓN DE LA RED ESPAÑOLA DE BACTERIAS LÁCTICAS Bacterias Lácticas en Alimentación y Salud; 2019

Red española de bacterias lácticas

Las feruloil esterasas (FE) sonenzimas responsables de la liberación de ácidos hidroxicinámicos (AH), talescomo el ácido ferúlico, cafeico, p-cumárico y sinápico, a partir de susformas esterificadas no biodisponibles presentes en la pared celular decereales, frutas y verduras. Estos ácidos son compuestos fenólicos condemostrada actividad antioxidante. Numerososestudios relacionan el consumo de alimentos ricos en AH con una menorincidencia de enfermedades asociadas a desequilibrios en el estado oxidativodel organismo, como diabetes tipo 2, obesidad, síndrome metabólico, entreotras. Las FE son producidas por distintos géneros bacterianos presentes en elintestino humano y animal y se han descrito en algunas cepas aisladas de alimentos,principalmente lactobacilos. No obstante, existe muy poca información sobre FEde L. fermentum. Estudios previosevidenciaron que la administración de L.fermentum CRL1446, cepa probiótica con actividad FE, mejora el estadooxidativo y metabólico de ratones sometidos a diferentes dietas demalnutrición. Dado que las FE jugarían un rol fundamental en el efecto beneficiososobre la salud del huésped, resulta de interés caracterizar las mismas. Objetivo: Caracterizar laenzima responsable de la actividad FE en L.fermentum CRL1446.Métodos: Se amplificópor PCR el gen que codifica una posible enzima con actividad FE (GenBankPNV58462.1) y se clonó en el vector pURI3-Cter. La proteína recombinante se hiperprodujoen Escherichia coli BL21 (DE3)empleando isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) como inductor de laexpresión del gen y se purificó por cromatografía de afinidad. Su pureza se determinópor electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Laespecificidad de sustrato se determinó mediante un método espectrofotométricofrente a sustratos cromogénicos (p-nitrofenil-ésteres de ácidos grasos de C2 aC16). El perfil de sustratos sobre los cuales actúa la enzima fue evaluadousando una librería de 43 ésteres comerciales. El efecto de temperatura, pH ydistintos aditivos (iones metálicos, surfactantes, inhibidores, agentesreductores, etc.) sobre la actividad esterasa se determinó empleandop-nitrofenil butirato (pNP-C4).Resultados:Se logró hiperproducir una proteína de masa molecular aproximada de 27 KDa. Lamisma presentó mayor especificidad de sustrato frente a pNP-C4. De los 43 ésteresensayados en la librería, la enzima presentó una mayor actividad hidrolíticasobre acetato de propilo e hidrolizó eficazmente los sustratos modelo deactividad FE (cafeato, sinapato, ferulato y p-cumarato de metilo), evidenciandoque es una FE. La enzima presentó actividad óptima entre 30-40°C, mostrando a55°C una actividad residual del 83%. Fue activa en el rango de pH de 5 a 8, presentandomáximo de actividad a pH 6-7. La actividad fue inhibida en presencia de algunosaditivos, mientras que ninguno actuó como activador.Conclusión: Se logró caracterizarbioquímicamente la feruloil esterasa de L.fermentum CRL1446, lo que permitirá proyectar nuevas aplicacionesbiotecnológicas de la misma.