Monitoreo de la cepa Lactobacillus salivariusDSPV 001P de origen aviar por Electroforesis en Gel por Campos Pulsados

BLAJMAN JESICA; BERISVIL AYELEN; ROMERO SCHARPEN, A.; ASTESANA DIEGO; ZIMMERMANN JORGE ALBERTO; CONTI GISELA; ROSMINI MARCELO RAUL; ZBRUN VIRGINA; SEQUEIRA, GABRIEL; FRIZZO LAUREANO

Casilda

Jornada; XVI Jornadas de Divulgación Técnico-Cientificas III Jornada Latinoamericana; 2015

El conocimiento relacionado a la localización de las bacterias probióticas dentro del ambiente complejo de la microbiota intestinal es muy escaso y el monitoreo de estas bacterias in vivo representa un gran desafío.La técnica de Electroforesis en Gel por Campos Pulsados (PFGE) es considerada actualmente el ?gold standard? de los métodos de tipificación molecular. Esta técnica permite tipificar cepas de la misma especie, para asípoder determinar diferencias genéticas entre ellas por medio de la digestión y separación de fragmentos de ADN1. Este experimento fue diseñado con la finalidad de comprobar si la cepa potencialmente probiótica Lactobacillus salivarius DSPV 001P administrada a pollos parrilleros presentaba diferencias con la que posteriormente se recuperaba desde el tracto gastrointestinal. Para obtener el perfil genómico de todas las cepas (L. salivarius DSPV 001P identificada, L. salivarius DSPV 001P liofilizada, L. salivarius DSPV 001P recuperada desde buche y L. salivarius DSPV 001P recuperada desde ciego) se usó la metodología basada en PFGE. Una alícuota de un cultivo overnight de cada una de las cepas fue transferida a un volumen de 4 ml de caldo MRS y posteriormente incubada a 37 ºC durante 18 h en anaerobiosis. Los cultivos fueron centrifugados durante 5 min a 5000 g. El sobrenadante fue descartado y el sedimento resuspendido en 1,8 ml de NaCl 0,85%. La densidad óptica (DO) de las suspensiones celulares fue ajustada a DO 2,0. La agarosa de bajo punto de fusión al 2% (Pulsed Field Certified Agarose, Bio-Rad®) fue calentada en el microondas a potencia baja y mantenida en baño termostatizado a 55 ºC. Un volumen de 150 μl de agarosa fundida fue adicionado a 150 μl de suspensión celular. Inmediatamente, la mezcla fue dispensada en los pocillos del molde para plugs, evitando la formación de burbujas. Se prepararon dos plugs por muestra, los cuales se dejaron solidificar en la heladera (4 ºC) por 5 min. Los moldes se abrieron y los plugs fueron transferidos con una espátula a tubos falcon conteniendo buffer NET con lisozima (10mg/ml) (Fluka®). Los tubos fueron colocados en una gradilla e incubados en un baño termostatizado a 37 ºC por 24 h. Seguidamente, cada plug se transfirió a un tubo falcon con buffer de lisis 50 mM Tris pH 8,50 mM ácido etildiaminotetraacético (EDTA), 1% Lauril sarcosina sódica pH 7,6 y 0,5 mg/ml de Proteinasa K (Promega® ? Madison, USA) y se incubó a 37 °C durante 24 h. Luego, los tubos fueron retirados del baño termostatizado y el buffer de lisis descartado cuidadosamente. Para los lavados, se añadió 10 ml de buffer Tris-EDTA (TE) estéril (Tris 10mM; EDTA 1 mM, pH 8,0), dejándose en baño termostatizado a 55 ºC por 40 min (este paso de lavado se repitió en cuatro ocasiones)2. Finalmente, los plugs se trasladaron a microtubos con 2 ml de buffer TE 1X estéril, y se mantuvieron a 4 ºC hasta su utilización posterior. Para la digestión enzimática se realizó una dilución del buffer de la enzima 10X con agua de calidad molecular y la enzima de restricción SmaI. El ADN bacteriano que estaba dentro del plug fue digerido con la enzima de restricción SmaI utilizando una concentración de 15 unidades de enzima por plug y un tiempo de incubación de 5 h a 25 °C. Los fragmentos de ADN digeridos dentro de los plugs fueron separados mediante PFGE en un gel de agarosa al 2% en buffer TBE 0,5X (Tris-Borato-EDTA). Una vez solidificado el gel, se incorporó cada muestra en una calle diferente y se aplicó encima una capa de agarosa al 2% como sellador. La electroforesis se llevó a cabo en un equipo de electroforesis en campo pulsado CHEF-DR III (Bio-Rad) con buffer TBE 0,5X bajo las siguientes condiciones: 6 V/cm (cambio de orientación inicial 5 s, cambio de orientación final 35 s) durante 18 h a 14 °C. Después de la electroforesis, los geles fueron teñidos 30 min en bromuro de etidio (10 mg/mL). La imagen fue capturada y finalmente guardada para su interpretación posterior. Elcoeficiente de similitud entre L. salivarius DSPV 001P identificada, L. salivarius DSPV 001P liofilizada, L. salivarius DSPV 001P recuperada de buche y L. salivarius DSPV 001P recuperada de ciego fue del 100%. Todas las muestras presentaron un idéntico patrón de restricción, en tamaño y número de fragmentos. En conclusión, la técnica PFGE permitió inferir que todos los aislamientos tenían la misma procedencia, y es una técnica adecuada para el monitoreo in vivo de cepas probióticas, ya que posee alto poder discriminatorio, sus resultados son reproducibles y es de rápida ejecución y comparación.