VIABILIDAD DE Lactiplantibacillus plantarum LP5 EN MUESTRAS DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EMPRESA LÁCTEA

RUIZ, JULIA; CONTI J.P.; JULIARENA, M.A.; FERNÁNDEZ, DANIEL; MARCELO SANZ; MEDINA CANALEJO LM; ANALÍA ETCHEVERRÍA

Casilda

Jornada; XXIII Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas; 2023

Universidad Nacional de Rosario

A partir de la década del ´90, la producción lechera argentina se incrementó como consecuencia de una mayor eficiencia productiva y de un sostenido proceso de tecnificación. Este crecimiento, ha dado lugar a un aumento de efluentes derivados de la industria láctea. Este tipo de plantas elaboradoras de leche y productos derivados utilizan grandes volúmenes de agua para llevar a cabo todos los procesos productivos. Si estos no reciben un correcto tratamiento, pueden producir un efecto negativo en el ambiente tanto por la contaminación como por los olores que se generan. El tratamiento de aguas residuales debe apuntar a la eliminación de microorganismos patógenos, sustancias tóxicas y a la retención de sólidos, evitando que lleguen y contaminen los cursos naturales de agua y reduciendo el olor que producen. Considerando el impacto negativo que tiene la permanencia de aguas residuales en el ambiente, con el riesgo que implica para la salud pública y ambiental, una de las herramientas que se plantea en la actualidad para su tratamiento es el uso de microorganismos eficientes que se pueden aplicar con un mínimo de costos y un máximo de beneficios. Por eso, su estudio como biorremediadores de ambientes contaminados, tanto por materia orgánica, como por microorganismos patógenos, es una meta por cumplimentar en los años venideros a modo de contar con un ambiente más saludable y limpio1. Los microorganismos eficientes son agentes biológicos que aceleran los procesos bioquímicos naturales de degradación y, por ende, poseen potencial metabólico para el tratamiento de las aguas residuales. Bacterias potencialmente probióticas pueden emplearse con esta finalidad ya que son capaces de absorber materia orgánica limitando la cantidad de nutrientes disponibles para microorganismos patógenos y deteriorantes. Las bacterias probióticas reaccionan con la materia orgánica y forman compuestos orgánicos simples como alcoholes y aminoácidos que dan como resultado una reducción de materia orgánica y sólidos, disminución del mal olor y de la cantidad de barro2. La actividad probiótica o inhibitoria de las bacterias, se relaciona con la capacidad de sintetizar sustancias antimicrobianas como ácido láctico (producto del metabolismo fermentativo), peróxido de hidrógeno, y bacteriocinas. Un consorcio de microorganismos benéficos en aguas residuales representaría un tratamiento con fundamento ecológico, ya que no dejaría residuos y por ende, no contaminaría el ambiente, de bajo costo, efectivo para disminuir los microorganismos patógenos y reducir el olor. Este consorcio microbiano puede estar liderado por las bacterias ácido lácticas que condicionan el pH, lo que podría favorecer la eliminación de coliformes fecales y otros patógenos en las aguas residuales. Investigadores han informado que Lactiplantibacillus plantarum se encuentra en distintos nichos en la naturaleza y es capaz de crecer en diferentes sustratos debido a su capacidad de adaptarse a las exigentes condiciones de procesos de biorrefinería y biodegradación3. Uno de los primeros pasos para la aplicación de L. plantarum en aguas residuales, implica un estudio de viabilidad en esas condiciones. El objetivo de este estudio fue evaluar la viabilidad in vitro de L. plantarum LP5 en muestras de efluentes para luego desarrollar un plan de acción que permita mejorar la calidad microbiológica y fisicoquímica de aguas residuales de la industria láctea.En este estudio se trabajó con la empresa láctea Cooperativa Nuevo Amanecer situada sobre el km 135 de la Ruta Nacional 226 a unos 30 km de la ciudad de Tandil, Buenos Aires, Argentina. Las muestras de aguas residuales fueron obtenidas de la primera laguna de desagüe situada en el predio de la cooperativa a unos 430 m de la planta procesadora de lácteos. La toma de muestra fue realizada mediante un colector metálico sanitizado con alcohol y enjuagado varias veces con la muestra hasta su colección en un recipiente limpio y sanitizado. El muestreo para la prueba de viabilidad fue realizado por triplicado. Cada muestra fue inmediatamente trasladada al Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología de la FCV-UNCPBA, CIVETAN para su estudio. Para la realización de los análisis, las muestras fueron templadas a temperatura ambiente (14°C ± 2) y homogeneizadas. Cada muestra representativa del volumen de la laguna fue fraccionada en 6 matraces con 1L. Primero se determinó la presencia de algún microorganismo capaz de crecer en el agar selectivo para L. plantarum (LPSM). Para ello, fue sembrada una alícuota de la muestras y diluciones seriadas en el medio LPSM e incubada en las condiciones óptimas para L. plantarum. Esta prueba inicial mostró recuentos que oscilaron los 4,85 log10UFC/mL. Estos resultados indicaron el crecimiento de alguna bacteria que metaboliza el medio. Si bien las características microbianas no fueron totalmente típicas del L. plantarum, el medio no permitía discriminar la cepa inoculada del resto de la población. Entonces para poder monitorear la cepa L. plantarum LP5 a lo largo del estudio, se realizó un proceso de resistencia de L. plantarum LP5 a rifampicina para diferenciarla de la población microbiana existente. Una colonia individual fue sembrada en agar LPSM con 1 μg/ml de rifampicina e incubada durante 48 h en anaerobiosis a 37°C. El procedimiento fue repetido aumentando gradualmente la concentración del antibiótico hasta alcanzar una resistencia bacteriana de 100 μg/ml. Es importante aclarar que esta cepa resistente (L. plantarum LP5r) solo fue utilizada in vitro, a fines de ser monitoreada. Al momento de realizar un plan de acción en el predio, será utilizada la cepa original (L. plantarum LP5) de manera que no se exponga al ambiente una bacteria resistente al antibiótico. La cepa L. plantarum LP5r, fue reactivada en caldo de Man Rogosa and Sharpe (MRS) durante 24 h a 37°C en microaerofilia y luego cultivada en agar LPSM con rifampicina (LPSMr) durante 48 h a 37°C en microaerofilia. A partir del crecimiento en placa, fue tomada una colonia y cultivada en caldo MRS durante 24 h a 37°C en microaerofilia. El cultivo de L. plantarum LP5r fue centrifugado a 5000 xg, lavado y suspendido en solución salina al 0,85% de cloruro de sodio. La concentración final para el tratamiento de las muestras fue de 8 logUFC/ml, equivalente a una absorbancia de 0,5600nm calculada en base a la curva de calibración de la cepa. El inóculo fue incorporado a las muestras en diferentes concentraciones: 0,1% (T1), 0,5% (T2), 1% (T3), 2% (T4) y 10% (T5). Una muestra no fue inoculada para ser considerada control (CT). Semanalmente fueron tomadas alícuotas (1 mL) de cada muestra para evaluar la viabilidad del cultivo L. plantarum LP5 a lo largo del tiempo. Los muestreos fueron realizados los días 0, 7, 14, 21 y 28 pos-inoculación. A partir de la muestra, fueron realizadas diluciones seriadas que se sembraron en agar LPSMr. Las placas fueron incubadas en microaerofilia a 37°C durante 48h. Pasado el tiempo se realizó el recuento bacteriano correspondiente a las colonias típicas. Los resultados de viabilidad en este estudio piloto permitieron determinar la permanencia y viabilidad de L. plantarum LP5r en las aguas residuales, al menos durante 28 d (Tabla 1). Tabla 1: Cuantificación de L. plantarum LP5 en agar LPSM y en agar LPSMrLa concentración óptima de L. plantarum LP5r adicionado fue del 10%, mostrando un conteo promedio al inicio (t0) de 6,45 log10UFC/mL y al final del estudio (t28) de 6,80 log10UFC/mL.Este estudio, permitió confirmar la viabilidad de L. plantarum LP5 durante al menos un mes en muestras de aguas residuales de la empresa láctea. Estos resultados darán lugar a un estudio in vitro de la incidencia de L. plantarum LP5 sobre la calidad microbiológica y físico-química de muestras de aguas residuales de la cooperativa láctea a mayor escala y durante más tiempo, para finalmente, desarrollar un plan de acción en el predio de la planta que permitirá pretratar los efluentes antes de ser vertidos en la laguna. Este potencial, contribuiría a mantener un equilibrio natural microbiano mejorando la calidad de las aguas residuales, reduciendo la presencia de bacterias implicadas en ETA y minimizando el impacto medioambiental.