Evaluación de protocolos de criopreservación de Saccharomyces eubayanus, una levadura patagónica con potencial biotecnológico.

CARUSO, A.; VILACOBA, E. ; LIBKIND, D.; SANTOS, M.V.

Jornada; XII JORNADAS DE JÓVENES INVESTIGADORES UBA; 2023

FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UBA

Saccharomyces eubayanus es una levadura psicrotolerante presente en la Patagonia Argentina con gran potencial en la industria alimenticia para la elaboración de cervezas y panificados. Con el fin de asegurar su disponibilidad a largo plazo es preciso encontrar la mejor estrategia para criopreservar de manera adecuada este valioso recurso. El proceso de criopreservación mediante congelación implica que la muestra puede presentar tres zonas con velocidades distintas: enfriamiento inicial, zona plateau (cambio de fase) y enfriamiento de matriz congelada.Los objetivos de este trabajo fueron a) caracterizar la cinética de crecimiento S. eubayanus y el tamaño de las células en cada fase, y b) determinar el efecto de las velocidades de congelación y la aplicación de glicerol en la viabilidad y vitalidad post protocolo de criopreservación de dicha especie.Se midió el crecimiento a 20°C y 180 rpm de S. eubayanus CRUB 1568T vs tiempo por espectrofotometría a 600 nm y recuento celular en cámara de Neubauer. Se probaron distintos modelos con el fin de determinar cuál alcanzaba el mejor ajuste. El área y el diámetro de la célula en cada fase se midió mediante imágenes y postprocesamiento en ImageJ. Para la criopreservación, se tomaron muestras en fase estacionaria temprana, se centrifugaron y se resuspendieron en a) glicerol 10% p/p y b) agua destilada. Finalmente, se evaluaron la viabilidad en UFC/ml y la vitalidad (diámetros de las colonias a las 48 horas) tras someter los crioviales a 4 protocolos de criopreservación:P1) directo a ultrafreezer (UF) -80ºC y almacenamiento en UFP2) directo a nitrógeno líquido (LN2) -196ºCP3) congelación en CoolCell® en UF y almacenamiento en UFP4) congelación en CoolCell® en UF y almacenamiento en LN2Para cada protocolo se calculó la velocidad de congelación a partir de medidas con termocuplas tipo T acopladas a un adquisidor TESTO (Alemania).Con respecto a la curva de crecimiento, el modelo de Weibull presentó el mejor ajuste (R2adj=0.98, RSS=0.91). El tamaño en las distintas fases no difirió significativamente (p>0.05), siendo el diámetro promedio en la fase exponencial 4.73 μm y su desviación estándar (ds) 0.74 μm, sin embargo a mayor antigüedad hubo una creciente dispersión de tamaños; ds =1.24 μm en fase estacionaria tardía. Los protocolos que presentaron mejor performance fueron el 1, 3 y 4 sin glicerol, presentando un porcentaje de viabilidad igual a 60.9%, 64.2% y 58.8%, respectivamente. Asimismo, en ausencia de glicerol, estos protocolos exhibieron mejores resultados de vitalidad (diámetro promedio entre 1.016-1.018 mm a las 48 h). La velocidad inicial de congelación resultó igual a 6.75°C/min para P1, 2.05°C/min para P3 y P4, y 51.9°C/min para P2. A la luz de estos resultados, se podría inferir que para S. eubayanus la utilización del glicerol para la criopreservación podría ser contraproducente. En concordancia con la literatura científica, velocidades de congelación en el rango 1-10 °C/min alcanzaron mayor viabilidad.