Uso de las técnicas MSP-PCR y RFLP-ITS para la identificación de levaduras fermentadoras asociadas a Cyttaria hariotii

ULLOA, R; LIBKIND, DIEGO; FONTENLA, S; LÓPES, C; VAN BROOCK, M

Córdoba, Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología; 2007

Asociación Argentina de Microbiología

El estudio convencional de levaduras de ambientes naturales implica numerosos aislamientos y su posterior caracterización e identificación es tediosa y en general poco efectiva. La identificación precisa de levaduras a nivel de especie, requiere el uso de técnicas de biología molecular, en particular de secuenciación del ADNr. En este trabajo se aplicó el uso combinado de 2 técnicas moleculares: MSP-PCR y RFLP-ITS, para la identificación de levaduras fermentadoras asociadas al estroma de Cyttaria hariotii - hongo parásito de árboles del género Nothofagus - del Parque Nacional Nahuel Huapi, Patagonia, Argentina. Se obtuvieron 72 aislamientos de levaduras fermentadoras utilizando un medio de cultivo selectivo con etanol. Los aislamientos fueron caracterizados con la técnica de MSP-PCR fingerprinting empleando los cebadores M13, (GAC)5 y (GTG)5; en base a la similitud de los perfiles de bandas obtenidos los aislamientos fueron clasificados en 10 grupos (G1 a G10). Algunos aislamientos representativos de cada grupo fueron estudiados mediante RFLP-ITS. El tamaño del fragmento ITS para los grupos G1 a G4 fue de 850 pb, tamaño característico de Saccharomyces “sensu stricto”. Los restantes grupos presentaron tamaños menores de ITS que oscilaron entre 460 y 750 pb. La especie S. cerevisiae se encontró en (G3) y un segundo conjunto que abarca los G1, G2 y G4; identificados como S. bayanus ó S. uvarum. Entre los grupos no sacaromicéticos se reconocieron a las especies Zigosaccharomyces cidri (G7) y Pichia delftensis (G8 y G9) mientras que no fue posible identificar las especies comprendidas en los grupos G5, G6 y G10. Para confirmar las identificaciones obtenidas por RFLP-ITS se procedió a la secuenciación de las regiones D1/D2 e ITS del ADNr 26S. Dentro de los grupos sacaromicéticos, se observó que G1 y G4 correspondieron a S. uvarum y G2 a S. bayanus. Se confirmaron las identificaciones RFLP-ITS para los grupos no-sacaromiceticos, pudiendo detectar 3 especies nuevas de los géneros Hanseniaspora y Candida. La técnica de MSP-PCR permitió el rápido agrupamiento de los aislamientos co-específicos siendo el cebador M13 el que ofreció una mejor diferenciación de los grupos. El uso de RFLP-ITS permitió una correcta identificación de los aislamientos, permitiendo en la mayoría de los casos prescindir de la secuenciación. El uso combinado de las técnicas MSP-PCR y RFLP-ITS se muestra como una herramienta eficaz para el estudio de la biodiversidad de levaduras en ambientes naturales.