Comparación de métodos de lisis y permeabilización de Streptococcus thermophilus para su uso en quesería

GUILLERMO PERALTA; CARINA BERGAMINI; ERICA HYNES

Santa Fe

Simposio; II Simposio Argentino de Lactología; 2012

INLAIN - UNL/CONICET

Los métodos de lisis y permeabilización en bacterias son de gran importancia para el estudio de las enzimas intracelulares, y la atenuación de cultivos ofrece una importante aplicación como biocatalizadores no viables, especialmente dirigidos a la formación de flavour en queso. Streptococcus thermophilus posee enzimas clave para la transformación de aminoácidos en compuestos de aroma, pero esta transformación no se verifica en quesos, lo que se ha asociado al mantenimiento de la integridad de las células. El objetivo de este trabajo fue estudiar diferentes métodos de lisis y permeabilización de dos cepas de Streptococcus thermophilus para su uso posterior en quesería. Para ello se ensayaron agentes químicos: mutanolisina 100 y 200 U/mL, etanol 40%, Dodecil Sulfato de Sodio 0,1% (SDS), y agentes físicos: ultrasonido, calor 60ºC, congelamiento -80ºC y disrupción mecánica en un disruptor celular. Se realizaron recuentos en placa, y se determinó la actividad de dos enzimas intracelulares, lactato dehidrogenasa (LDH) y beta-galactosidasa (b-GAL), para determinar la influencia de los tratamientos en la accesibilidad de las mismas a sustratos específicos. Las enzimas se cuantificaron en las suspensiones celulares enteras (actividad total) que reflejan tanto la permeabilización como la liberación de enzimas, y en el sobrenadante libre de células (actividad liberada) que es utilizada como un índice de lisis. Los tratamientos de etanol y SDS provocaron una reducción del 100% de la viabilidad celular, mientras que la mutanolisina provocó una disminución de un orden logarítmico. La influencia de los tratamientos de ultrasonido, disruptor, calor y congelamiento en los recuentos celulares fue variable; en general, se produjo una disminución de uno a dos órdenes logarítmicos. Los tratamientos con alcohol y SDS aumentaron notablemente la actividad total de la b-GAL, mientras que produjeron un mínimo incremento en la b-GAL liberada. Similar efecto se observó para el tratamiento con SDS sobre la LDH, mientras que en las muestras tratadas con etanol los niveles de LDH fueron bajos. Esta última observación podría deberse a una desnaturalización de LDH por el agente químico aplicado. Los niveles de las dos enzimas ensayadas, aumentaron en los extractos tratados con mutanolisina y ultrasonido, presentando similares niveles la actividad total y la liberada. El tratamiento con el disruptor mostró la mayor liberación de b-GAL, mientras que produjo un leve incremento de la LDH, lo que podría atribuirse a un efecto negativo del tratamiento sobre esta enzima. Los métodos de calor y congelado no afectaron la liberación o accesibilidad de LDH y b-GAL. Se concluye que los tratamientos de SDS y etanol resultaron adecuados para obtener permeabilización, mientras que la mutanolisina, ultrasonido y disruptor resultaron métodos apropiados de lisis. La LDH mostró cierta inestabilidad frente a algunos de los agentes ensayados, lo que reduce su utilidad como indicadora de lisis o permeabilización en el presente estudio, debiéndose complementar con otras determinaciones enzimáticas, o análisis específicos de integridad de la membrana celular como citometría de flujo.