Informe Técnico

MARANGI MJ.; POSE G.

2017-10-01/2018-04-01

1-6

Biológica

Sanidad vegetal

Se llevó a cabo un estudio microbiológico a fin de determinar la posible implicancia de microorganismos como causa de dos sintomatologías consistentes una en casos de gomosis y otra, de manchas marrones en los laterales de los frutos de almendro jóvenes, observadas en plantaciones de Luis Beltrán, Valle Medio de Río Negro. En principio, respecto al primer caso, se sospechaba de casos de Antracnosis del almendro, producida por especies del género fúngico Colletotrichum.METODOLOGIA:-Manchas laterales. En el caso de las almendras que exhibieron lesiones laterales se analizaron 2 muestras. Los frutos se lavaron con agua de grifo, se desinfectaron superficialmente sumergiéndolos en una solución de Hipoclorito de Sodio 1% durante 3 minutos y se enjuagaron 2 veces con agua destilada estéril. Las muestras se cortaron a la mitad y se extrajeron asépticamente trozos internos de la lesión que se inoculaon en placas conteniendo medio Agar Papa Dextrosa suplementado con Cloranfenicol (0.1 g/l) (PDA+C) para evaluar el desarrollo fúngico. Otros trozos obtenidos de la lesión se maceraron y se colocaron en tubos de ensayo conteniendo solución fisiológica estéril. Luego de homogeneizar (vortex), se sembró 0,1 ml de la suspensión en medio Luria Bertani (LB) para determinar el desarrollo bacteriano. Las placas se incubaron a 25°C durante 7 días y a 27°C durante 4 días, respectivamente.Gomosis. Se utilizaron dos procedimientos diferentes de análisis para asegurar el aislamiento de los microorganismos. Se analizaron 5 muestras que la lesión presentaba sustancia gomosa.En el primer caso, la mitad de las muestras se analizó utilizando el procedimiento descripto anteriormente, realizando el macerado de los tejidos en tubos Eppendorfs en lugar de utilizar tubos de ensayos debido al pequeño tamaño de la lesión, y por ende, poca cantidad de material para el análisis.El segundo procedimiento consistió en desinfectar y enjuagar los frutos siguiendo el procedimiento descripto previamente. Luego, se colocaron las muestras individualmente en recipientes plásticos cerrados, conteniendo un trozo de algodón húmedo, con el fin de crear una cámara húmeda, para permitir el desarrollo microbiano en la lesión. Los recipientes así preparados se incubaron a 27°C durante 14 días El micelio desarrollado en los frutos, luego de la incubación, se sembró en placas de PDA+C (McKay y col., 2009). Asimismo, sobre estas muestras, se desinfectó la superficie con alcohol 70%, se cortaron los frutos a la mitad y se extrajeron asépticamente trozos de tejido desde la lesión que se sembraron en PDA+C. Otros trozos de tejido se colocaron en tubos Eppendorfs conteniendo solución fisiológica estéril (determinación de hongos). Luego de homogeneizar, 0,1 ml de la suspensión fue inoculado en medio LB. También se realizó siembra por estrías en dicho medio determinación de bacterias). Las placas se incubaron a 25°C durante 7 días y a 27°C durante 4 días, respectivamente.-Determinación del género y especie de los microorganismos aislados.En el caso de los aislamientos fúngicos, los géneros se determinaron a partir de las características macro y microscópicas de los aislamientos.Respecto a bacterias, las colonias que mostraron características morfológicas correspondientes al género Xanthomonas sobre LB fueron inoculadas en el medio diferencial para este género, Xan-D. Las placas se incubaron a 27°C durante 7 días. El género y la especie de las colonias que resultaron positivas en dicho medio se confirmó mediante técnicas moleculares.La extracción de ADN se llevó a cabo a partir de pellets obtenidos de suspensiones de bacterias con una DO (600nm)=0,2 (1 a 5 x 108 CFU/ml aproximadamente). Las suspensiones fueron centrifugadas a 7500 RPM durante 10 minutos, descartándose los sobrenadantes. Los pellets se conservaron a -80°C hasta su uso. La extracción de ADN se realizó utilizando el kit ?DNeasy blood and tissue mini kit? (Qiagen) con un protocolo de pre-tratamiento para bacterias Gram negativas siguiendo las instrucciones del proveedor. El ADN genómico extraído se cuantificó utilizando un fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies). Se realizó la amplificación (PCR) y secuencia de los fragmentos amplificados con los primers especie específicos para X. arborícola XarbQF y XarbQR (gen qumA - quinato deshidrogenasa (Pothier et al., 2011).