Determinación de especies de Eurotium mediante secuencias ITS y b-tubulina, y perfil de producción de metabolitos secundarios tóxicos

GRECO M.; KEMPPAINEN M.; PARDO A.; POSE G.

Congreso; XIII CONGRESO ARGENTINO DE MICOLOGÍA - XXIII JORNADAS ARGENTINAS DE LA ASOCIACIÓN DE MICOLOGÍA - 1A REUNIÓN DE LA ASOCIACIÓN MICOLÓGICA CARLOS SPEGAZZINI; 2014

Las especies del género Eurotium son de particular interés debido a su capacidad xerofílica,siendo consideradas las más destructivas desde el punto de vista del deterioro y pérdida dealimentos (Abellana et al., 1999). A su vez, el género Eurotium ha sido reportado comoimportante productor de micotoxinas y metabolitos secundarios (Abarca et al., 2000; Samson etal., 2000; Butinar et al., 2005; Slack et al., 2009).El objetivo del presente trabajo fue el de confirmar por técnicas moleculares la identidad dedistintas especies del género Eurotium, identificadas previamente en base a característicasmorfológicas y por microscopía electrónica de barrido de las ascosporas, y determinar el perfilde producción de metabolitos secundarios tóxicos por HPLC-MS.Para la identificación a nivel molecular, veinte aislamientos, provenientes de alimentosbalanceados destinados a la producción pecuaria, fueron inoculados en placas de Petriconteniendo medio de cultivo CY20S e incubados a 25ºC durante 7 días. Luego del período deincubación, se colectó el micelio, se procesó en nitrógeno líquido y se efectuó la extracción deADN. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron sobre la región ITS (primers ITS-1e ITS-4; Yun et al., 2009), y la secuencia del gen codificante de b-tubulina (primers bt2a y bt2b;Hong et al., 2011). El análisis filogenético se realizó con el programa MEGA 6 (Tamura et al.,2013) y las secuencias de referencia fueron obtenidas del GenBank.A partir de los árboles filogenéticos construidos con el método de Maximum Likelihood, selogró observar que con la secuencia ITS se obtienen dos grupos que abarcan a las especies E.amstelodami y E. chevalieri, y por otra parte a las especies E. repens y E. rubrum, nopudiéndose diferenciar entre especies dentro de cada grupo. En cambio, con la secuencia deb-tubulina se logró confirmar con fuerte apoyo la identidad de los aislamientos. Las especiesfueron confirmadas como Eurotium amstelodami, E. chevalieri, E. herbariorum, E. repens y E.rubrum.Respecto de la determinación del perfil de metabolitos, los aislamientos respectivos seinocularon en 250 ml de caldo CYA con una suspensión de conidios alcanzando unaconcentración final de 1.104 conidios/ml, e incubados a 25ºC durante 15 días en oscuridad.Posteriormente, se realizó una doble extracción con acetato de etilo y se evaporó en rotavapor.El residuo se resuspendió en 1 ml de metanol y se analizó por HPLC-MS.Todos los aislamientos resultaron productores de las micotoxinas cladosporina y neoechinulinaA, 17 resultaron productores de echinulina y 18 de neoechinulina B.A partir de los resultados obtenidos se concluye que la secuencia de b-tubulina es la másapropiada para la identificación de especies de Eurotium y la co-ocurrencia de metabolitossecundarios es indicativa del potencial toxicogénico de este género.