Aislamiento de microorganismos alterantes autóctonos en sangre aviar obtenida en mataderos

BONANSEA,E.F., ALTINA, M.G., ZBRUN, M.V., SOTO, L.P., SIGNORINI, M.L., ROSMINI, M.R., FRIZZO, L.S.

Casilda, Provincia de Santa Fe (Argentina)

Jornada; XI Jornadas de Divulgación Técnico Científicas 2010; 2010

Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional de Rosario

Las proteínas de sangre de matadero pueden ser consideradas como un posible suplemento alimenticio debido a su elevado valor nutritivo. Además, su utilización contribuye a disminuir los problemas de contaminación generados por la industria cárnica evitando la pérdida de cantidades significativas de proteínas recuperables1. Por estos motivos se están buscando alternativas para su aprovechamiento en distintos procesos industriales. El inconveniente principal es su elevado grado de contaminación con bacterias aerobias presentes en la playa de faena, por lo que requiere un procesamiento inmediato. Diferentes estudios han aplicado la biopreservación mediante el uso de Bacterias Ácido Lácticas (BAL) autóctonas, utilizando sus propiedades antibacterianas2 in situ. Con el fin de determinar la capacidad antagonista futura de un cultivo bioprotector en fase de desarrollo, el objetivo de éste trabajo fue aislar y caracterizar microorganismos alterantes autóctonos de sangre aviar de matadero. Las cepas estudiadas cómo posibles alterantes fueron Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp, Pseudomonas fluorescens y Bacillus spp3. Para el análisis de éstos microorganismos se utilizaron medios de cultivos selectivos para cada uno de ellos, partiendo de diluciones de tres muestras de sangre de frigorífico. Para aislar E. coli, se sembraron placas de VRBL por vertido y se incubaron en aerobiosis 24h a 37°C, luego se repicaron colonias lactosa positivas en caldo Mac Conkey, el cual fue incubado 24h a 37°C. Los caldos con crecimiento se sembraron en agar EMB en superficie y se colocaron en estufa 24h a 37°C en aerobiosis. Se observaron colonias típicas de E. coli verdosas con brillo metálico y centro negro azulado. Para S. aureus, se sembraron en superficie placas de Baird Parker, incubándose a 37ºC durante 48h. S. aureus reduce el telurito que contiene el medio formando colonias gris–negras y halos claros producto de la hidrólisis de los lípidos de la yema de huevo. Para el aislamiento de Salmonella spp, se colocó 25ml de sangre en 225ml de agua peptonada bufferada, se incubó a 37°C  durante 24h. Posteriormente se inoculo 0,1ml en 10 ml de caldo rappaport (24h, 37ºC) y 1ml en 10ml de caldo selenito cistina (12h, 42°C). Las 2 muestras se sembraron en superficie en tres medios sólidos para determinar la presencia del microorganismo, agar XLD SS, BPLS y se incubaron 24h a 37°C. Para  el asilamiento de P. fluorescens, se sembraron por estría diluciones de la muestra en agar B de King (KB) y se incubó a 30°C durante 24h, se aislaron colonias oxidasa positivas. Para el aislamiento de Bacillus spp, se inoculo 1mL de sangre en 9mL de caldo nutritivo. Psteriormente se realizó un tratamiento térmico a 80ºC durante 5 minutos con el fin de eliminar las formas vegetativas presentes en la muestra y se incubo a 37ºC durante 24h para favorecer el crecimiento de los microorganismos resistentes al shock térmico. Se centrifugó el cultivo y el precipitado se resuspendió en agua triptonada. Por último se realizo una siembra en superficie de dicha dilución en agar PCA y se incubó a 37ºC durante 24h. Las colonias típicas crecidas en el medio fueron de bordes irregulares con diámetro entre 2-7mm de color crema. Posteriormente, se realizó un estudio in sílico, utilizando el sitio web NebCutter y las secuencias genéticas del gen ribosomal 16s (16S rDNA) de los alterantes obtenidas del GenBank. Con esta herramienta se simuló el corte con enzimas de restricción de dicho gen obteniendo un patrón de bandas específico para cada microorganismo. Luego se extrajo ADN genómico mediante la técnica de CTAB, se amplificó el 16S rDNA siguiendo el protocolo de Kim y Chun para realizar la restricción enzimática con Hinf I y Hae III, enzimas presentes en el stock del laboratorio. Los fragmentos obtenidos fueron separados en geles de agarosa al 2%. En todos los aislamientos realizados a partir de sangre de matadero, se encontraron en los medios selectivos colonias con características típicas de los microorganismos buscados. A todos ellos se les realizó la amplificación y restricción enzimática del 16S rDNA observando que las bandas de S. aureus, P. fluorescens y Bacillus spp coincidieron en un 100% con el estudio in sílico. Respecto a Salmonella spp y E. coli el patrón hallado no fue exactamente el mismo al determinado por el estudio in sílico, pero sí tuvieron coincidencia en el 60% de las bandas. La obtención de estos alterantes autóctonos aislados de la misma fuente que las bacterias del cultivo bioprotector en desarrollo, y confirmados 3 de ellos mediante técnicas moleculares simples, resulta de interés dado que permitirá una evaluación mas confiable de la capacidad antagonista de dicho cultivo in vivo.