Producción de sustancias antimicrobianas por Enterococcus faecium, un integrante de la microbiota de terneros jóvenes

ZBRUN, M.V.; SOTO, L.P.; FRIZZO, L.S.; SIGNORINI, M.L.; MARELLI, B.; DALLA SANTINA, R. & ROSMINI, M.R.

Casilda, Provincia de Santa Fe (Argentina)

Jornada; X Jornadas de Divulgación Técnico Científicas 2009; 2009

Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional de Rosario

A lo largo de los años las condiciones cada vez más intensivas de la producción pecuaria han ido afectando la capacidad de resistencia a enfermedades por parte de los animales. Los nuevos métodos de alimentación a base de sustitutos lácteos, la crianza intensiva que limita el contacto materno, la selección de animales más productivos y el incremento del uso de antimicrobianos favorecen las condiciones de estrés de los animales. Esto incrementa las deficiencias en la composición de la microbiota intestinal provocando que los desórdenes digestivos sean cada vez más frecuentes. Todo ello ha estimulado el interés por el uso de los aditivos alimentarios y las terapias alternativas no medicamentosas en reemplazo de los antibióticos utilizados en producción y sanidad animal, entre los cuales cabe destacar a los probióticos y las sustancias antimicrobianas naturales que ellos producen4. Son numerosas las experiencias que han demostrado sus efectos benéficos en la producción de materias primas de origen animal. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad de cepas lácticas autóctonas para producir sustancias antimicrobianas. Se utilizaron bacterias ácido lácticas autóctonas aisladas a partir de intestinos (duodeno, yeyuno, íleon, colon y ciego), cavidad bucal de terneros de crianza artificial y de vagina de vacas en la etapa pre-parto y que forman parte del cepario del Laboratorio de Análisis de alimentos. Los microorganismos se cultivaron en caldo MRS a 37 ºC durante 18 h y, previo tratamiento térmico, se centrifugaron para obtener el sobrenadante. Una vez llevado a pH 6,5 el sobrenadante fue esterilizado por filtración para obtener el extracto libre de células (ELC). La actividad antimicrobiana de los ELC fue evaluada usando el método de difusión en agar. El microorganismo indicador se inoculó en el agar ensayo y una vez colocado en las placas de petri se prepararon hoyos donde se colocaron los ELC a probar. Las zonas de inhibición detectadas alrededor de los hoyos indicaron la presencia de sustancias inhibitorias en los ELC. Los microorganismos productores de sustancias antimicrobianas se identificaron utilizando técnicas moleculares (amplificación del 16S rRNA, secuenciación y comparación en bases de datos). El ADN fue extraído según Marmur (1961)3, resuspendido en 50 μl de buffer TE y 5 μl fueron agregados directamente al tubo de PCR. La integridad del ADN fue visualizada por electroforesis en gel de agarosa al 0,7%. El gen 16S rDNA de cada aislamiento fue amplificado por PCR usando los primers 27F y 1492R, produciendo fragmentos de aproximadamente 1,5 Kpb. Cada tubo de reacción (50 μl) contenía: 10 μl 5X PCR buffer para Taq polimerasa, 1,5 mM MgCl2, 200 μM de cada dNTP, 0,4 μM de cada primer y 2U de Taq polimerasa. El programa para el termociclador fue el siguiente: 94 ºC durante 5 min; 30 ciclos de 94 ºC durante 1 min, 55 ºC durante 1 min y 72 ºC durante 1 min; finalmente un paso de extensión a 72 ºC durante 7 min. Luego de la reacción, los productos de PCR fueron detectados por electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v el cual fue teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. Tales fragmentos fueron secuenciados y alineados con las secuencias depositadas en la base de datos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)1. Posteriormente, se evaluó el efecto de los agentes físicos y químicos sobre la capacidad inhibitoria. Para ello se realizó un tratamiento con lisozima, proteinasa K y pepsina. Además se evaluó el efecto del etanol sobre la sustancia inhibidora. El efecto del calor se evaluó exponiendo el ELC a distintas condiciones -combinaciones tiempo/temperatura- y el efecto del pH fue evaluado ajustando las muestras a distintos valores de pH2. Una cepa de las evaluadas fue capaz de producir una sustancia inhibidora. La misma fue identificada como Enterococcus faecium. El tratamiento de la sustancia con etanol no afectó la capacidad inhibitoria del ELC. La prueba realizada con el ELC a distintos pH mostró que los pH extremos (pH 2 y pH 11) afectaron de diferente manera la capacidad de la sustancia para inhibir a la cepa sensible. Respecto a las enzimas utilizadas frente al ELC, se observó que todas produjeron una inactivación total de la capacidad inhibitoria de los microorganismos, con excepción de lisozima. En conclusión, la sustancia inhibitoria estudiada en el ELC es de naturaleza proteica, termoestable, sensible a pHs extremos y resistentes al tratamiento con un solvente orgánico como el etanol. BIBLIOGRAFÍA 1.     Benson, D.; Karsch-Mizrachi, I.; Lipman, D.; Ostell, J.; Rapp, B.; Wheeler, D. GenBank. Nucleic Acid Res. 28:15-18, 2000. 2.     Bhunia, A.K.; Johnson, M.C.; Ray, B. Purification, characterization and antimicrobial spectrum of a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici. J. App. Bacteriol. 65:261-268, 1988. 3.     Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 13:208-218, 1961. 4.     Rosmini, M.R.; Sequeira, G.J.; Guerrero-Legarreta, I.; Martí, L.E.; Dalla-Santina, R.; Frizzo, L.S.; Bonazza, J.C. Producción de Probióticos para animales de abasto: Importancia del uso de la microbiota intestinal indígena. Rev. Mex. Ing. Qca., 3:181-191, 2004.