Selección de bacterias ácido lácticas productoras de sustancias inhibitorias aisladas de sangre aviar de matadero

ALTINA, M.G.,BONANSEA, E.F., ZBRUN, M.V., SOTO, L.P., SIGNORINI, M.L., ROSMINI, M.R., FRIZZO, L.S.

Rosario, Provincia de Santa Fe (Argentina)

Jornada; XI Congreso y XXIX Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2010

Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional de Rosario

La sangre de matadero representa un grave problema por su alto poder contaminante y además es considerada una materia prima rica en proteínas de alto valor biológico. Por esto, ha sido necesario contar con mecanismos de conservación de la sangre frente a numerosos grupos bacterianos aerobios provenientes del estómago e intestino del animal faenado[1]. Una posibilidad para evitar el deterioro es la biopreservación mediante cultivos de Bacterias Ácido Lácticas (BAL). La acción preservativa de las BAL es atribuida a la combinación de la acción de metabolitos antimicrobianos producidos durante el proceso fermentativo, tales como ácido láctico, acético, peróxido de hidrógeno, diacetaldehido, reuterina y bacteriocinas[3]. Por lo mencionado anteriormente, este trabajo se focalizó en seleccionar cepas productoras de sustancias inhibitorias (SI), importantes en la bioconservación de la sangre aviar. Para realizar la búsqueda de cepas productoras de SI, se utilizaron cultivos over night en caldo MRS de las BAL aisladas de sangre de matadero aviar pertenecientes al cepario del DSPV-FCV-UNL los que fueron centrifugados de modo de eliminar cualquier resto celular. Seguidamente, 1,5 ml de cada sobrenadante fueron distribuidos en microtubos estériles, con la identificación de la cepa correspondiente (ELC SN). Al resto del sobrenadante, se le ajustó el pH entre 6 – 6,5 con NaOH 3M. Luego, se centrifugó nuevamente y fueron rotulados como extracto libre de células neutralizado (ELC N). Para realizar el ensayo de difusión en agar se utilizaron 7 cepas tapiz (Escherichia coli, Salmonella dublin, Pseudomonas fluorescens, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium y Lactobacillus acidophilus) incubadas over night en caldo BHI para las primeras 3 (cepas patógenas/alterantes halladas en sangre de matadero aviar) y en caldo MRS para el resto (BAL). Transcurrido el tiempo de incubación, se preparó una suspensión del microorganismo en agua estéril con una absorbancia de entre 0,2 y 0,3 a 620nm, correspondientes a una población del orden de 108 UFC/ml[4]. De esta suspensión se tomaron 80 microlitros de cada cepa tapiz y se inocularon tubos con agar suave (0,8%), MRS para BAL y BHI para el resto. Una vez que el medio agarizó, fueron realizados hoyos de 5 mm de diámetro utilizando sacabocados estériles. Posteriormente, fueron colocados en cada hoyo 50 microlitros del ELC (SN o N) a analizar, trabajando siempre bajo gabinete estéril. Después de dejar reposar las placas en heladera para permitir que los ELC difundieran en el medio agarizado, se llevaron a incubar a 37ºC durante 24 hs en aerobiosis. Finalizado el período de incubación, se observó presencia o ausencia de halos de inhibición de crecimiento del microorganismo tapiz. Los halos considerados positivos fueron los que presentaron un diámetro igual o mayor a 1mm[2]. De las 210 cepas probadas, 156 (75% del total) ELC SN presentaron 1 o más halos de inhibición frente a las cepas tapiz. Dentro de éste porcentaje, 46 microorganismos presentaron halos en las placas correspondientes a los ELC N. Respecto a las cepas tapiz, L. casei no fue inhibida por ningún ELC. L. acidophilus fue inhibido por 19 ELC SN y 3 ELC N. L. plantarum lo fue por 23 ELC SN y 11 ELC N. E. faecium presentó 89 halos de inhibición para los ELC SN pero solamente 3 para los ELC N. Tanto E. coli como S. dublin presentaron más de 100 halos de inhibición para los ELC SN pero solo 3 y 8 para los ELC N respectivamente. La cepa tapiz patógena/alterante restante, P. fluorescens, fue inhibida por 68 ELC SN y por 13 ELC N. Con estos resultados preliminares se puede concluir que aproximadamente el 75% de las cepas testeadas ejercen algún efecto inhibidor sobre el crecimiento de los microorganismos tapiz. A su vez, el 22% de los ELC N probados, presentaron inhibición frente a las cepas indicadoras. Esto demuestra la existencia de sustancias inhibidoras diferentes a los ácidos orgánicos. Con estas cepas se realizarán diversas pruebas para determinar qué tipos de sustancias se hallan presentes en los sobrenadantes seleccionando preferentemente a las productoras de bacteriocinas. Respecto a las cepas utilizadas como tapiz, L. casei no fue inhibida por ninguna SI, por lo cúal no la consideramos de utilidad para este tipo de ensayos Por su parte, L plantarum fue inhibida principalmente por los ELC N contrariamente a lo que ocurrió con E. faecium y L. acidophilus que lo fueron por los ELC SN. Concluyendo, este trabajo nos permitió detectar 46 cepas capaces de inhibir a las tapices mediante SI no ácidas.